氧化葡萄糖酸杆菌对葡萄糖利用的代谢改造及催化研究

论文摘要

氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）是一种在生物工业领域中广泛应用的生物催化剂,其细胞质外膜空间存在的众多氧化还原酶,可将羟基化合物不完全氧化生成相应的醛、酮或者酸,在维生素C、二羟基丙酮、米格列醇等工业生产中发挥着重要的作用。由于氧化葡萄糖酸杆菌膜结合葡萄糖脱氢酶（mGDH）的存在,会将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和酮基葡萄糖酸,不利于菌体的生长和催化氧化,所以工业上氧化葡萄糖酸杆菌的培养一般用高浓度的山梨醇或者甘露醇等。本课题的主要目的是通过同源交换基因敲除的方法构建一株可以在葡萄糖上获得良好生长和催化功能的氧化葡萄糖酸杆菌敲除菌株,同时研究氧化葡萄糖酸杆菌对葡萄糖的利用机制。1、构建敲除载体pSUP202mgdh::Gen,通过三亲本接合的方法对mgdh基因进行敲除,筛选验证敲除菌。所得到的敲除菌GDHK可以避免葡萄糖在菌体膜上就被氧化成葡萄糖酸和酮基葡萄糖酸,消除培养基中酸性环境对菌体生长的不利影响。实验表明敲除菌GDHK在10 g/L葡萄糖培养基上的最终菌体量（0.783 g DCW/L）较原始菌（0.514 g DCW/L）提高了52%,菌体对葡萄糖的得率也由0.049 gDCW/g提高到了0.141 gDCW/g。2、探讨敲除菌GDHK和原始菌621H分别在葡萄糖、山梨醇、甘露醇、和甘油四种碳源培养基上培养所得的静息细胞催化甘油生成二羟基丙酮以及催化乙二醇生成羟基乙酸的效果。实验表明原始菌621H在葡萄糖培养基上由于酸性环境的影响催化效果很差,而敲除菌则完全不存在这个问题,在葡萄糖上培养的敲除菌的催化效果是在葡萄糖上所生长原始菌的2-3倍,同时能够达到或超过在其他三种常用碳源上培养时所得到的催化水平。上述研究结果表明在这些催化应用方面,利用mgdh敲除菌株时,葡萄糖完全可以代替其他三种常用但较为昂贵的碳源,从而降低工业生产成本。3、同时,针对敲除菌比生长速率低于原始菌的现象,我们从基因转录水平上考察了GDHK胞内可能与葡萄糖利用相关的7个基因（galpz, galpw, glkz, glkw, sgdh, g6pdh, glnk）,实验结果证明了galpz, glkw, sgdh, glnk, g6pdh5个基因与葡萄糖利用相关。之后我们通过对galpz, glkw, sgdh这三个基因的敲除实验进一步验证了该结论并重建了氧化葡萄糖酸杆菌胞内葡萄糖代谢的途径。这些结论为深入提高氧化葡萄糖酸杆菌在葡萄糖培养基上的生长提供了一定的理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 1.1 氧化葡萄糖酸杆菌的分类和生理学特性
• 1.1.1 氧化葡萄糖酸杆菌的特性
• 1.1.2 氧化葡萄糖酸杆菌的脱氢酶系统
• 1.2 氧化葡萄糖酸杆菌的代谢途径
• 1.2.1 氧化葡萄糖酸杆菌的胞内代谢途径
• 1.2.2 氧化葡萄糖酸杆菌的胞外代谢途径
• 1.3 氧化葡萄糖酸杆菌的工业应用
• 1.3.1 二羟基丙酮的生产
• 1.3.2 维生素C的发酵生产（vitamin C）
• 1.3.3 D-葡萄糖酸的生产
• 1.3.4 合成米格列醇
• 1.3.5 氧化葡萄糖酸杆菌的其他应用
• 1.4 氧化葡萄糖酸杆菌对葡萄糖代谢
• 1.5 本课题研究的主要内容
• 第2章 氧化葡萄糖酸杆菌膜结合葡萄糖脱氢酶的敲除
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 酶和试剂
• 2.2.4 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 氧化葡萄糖酸杆菌总基因组的提取
• 2.3.2 大肠杆菌质粒的提取
• 2.3.3 大肠杆菌JM109感受态的制备
• 2.3.4 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.3.5 PCR产物纯化
• 2.3.6 目的条带的胶回收
• 2.3.7 常规PCR反应
• 2.3.8 DNA的酶切与连接
• 2.3.9 三亲本接合转移
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 基因片段的扩增
• 2.4.2 敲除载体的构建
• 2.4.3 三亲本接合以及敲除突变体的筛选
• 2.4.4 突变体的验证
• 2.4.5 敲除菌GDHK mgdh基因的回补
• 2.5 本章小结
• 第3章 氧化葡萄糖酸杆菌GDHK的生长和催化性能研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 药品和培养基
• 3.2.3 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 生长的测定
• 3.3.2 催化反应
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 G.oxydans 621H和敲除菌GDHK在葡萄糖培养基中的生长情况
• 3.4.2 敲除菌GDHK的生长代谢
• 3.4.3 原始菌621H和敲除菌GDHK在不同碳源培养基上的催化效果比较
• 3.5 本章结论
• 第4章 氧化葡萄糖酸杆菌的葡萄糖利用途径研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌株与质粒
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 酶和试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 荧光定量PCR
• 4.3.2 glkw,sgdh,galpz基因的敲除实验
• 4.4 实验结论
• 4.4.1 RT-PCR的结论
• 4.4.2 glkw,galpz,和sgdh基因敲除
• 4.5 基因敲除对菌体生长代谢的影响
• 4.6 本章结论
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 硕士期间论文发表情况
• 致谢