内质网应激偶联氧化应激信号通路在糖尿病肾病发病中的作用

论文摘要

研究背景和目的糖尿病肾病（DN）是糖尿病最严重的并发症之一,也是引起终末期肾病最主要的一个原因,但其发病机制迄今为止尚未阐明,缺乏有效的治疗手段。普遍观点认为,氧化应激在DN的发病机制中有很重要的地位,但临床实践证明,目前的抗氧化治疗并未能有效地遏制DN的发病和发展,故DN发病机制的阐明以及DN防治措施的研究已成为目前需要迫切解决的一个关键问题。近年研究表明,内质网应激（ERS）在糖尿病、胰岛素抵抗以及糖尿病相关血管并发症的发病机制中发挥重要作用。有研究发现,高糖可显著诱导肾小球系膜细胞ERS和氧化应激,同时细胞外基质（ECM）积聚增多,揭示了ERS可能与DN存在密切关系。理论与实践证据均表明ERS很可能参与了DN的发病过程,深入探讨ERS在DN发病机制中的作用,有可能会为临床DN防治的研究提供新的理论依据。已经有研究证实,应用化学分子伴侣4-苯基丁酸（4-PBA）调控ERS可有效抑制细胞的氧化应激,减轻细胞损伤,提示氧化应激可能受到ERS的调节,然而,动物模型中关于ERS与DN发病机制的研究,以及调控ERS对动物模型DN的发病和对高糖环境下系膜细胞的影响等效应性研究,目前在国内外尚未见报道,这是一个亟待解决的重要问题。据此,本研究拟通过建立DN大鼠模型与高糖刺激大鼠肾小球系膜细胞（RMCs）相结合的方式,观察DN大鼠肾组织和RMCs的ERS激活情况和变化规律,以及肾脏病理、氧化应激和炎症激活的变化情况,并通过利用4-PBA调控DN大鼠体内和RMCs的ERS强度,观察其对DN大鼠生理生化指标,以及DN大鼠肾脏和RMCs的ERS、氧化应激、炎症激活和细胞增殖的影响,从正反两方面确认ERS在DN发病机制中的作用,并探讨化学分子伴侣对DN的防治作用及其保护机制。对象和方法一、体内实验1.采用左肾切除加腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法复制DN大鼠模型,将动物随机分为正常对照组（NC组）、单纯DN模型组（DN组）和DN模型+4-PBA治疗组（DN+4-PBA组）。4-PBA按1 g/kg的剂量每日予治疗组大鼠灌胃,其余两组予等体积生理盐水灌胃。2.各组大鼠分别于治疗开始后第4、8和12周末进行尿蛋白排泄率（UPER）、血糖（BG）、体质量（BW）、肾质量（KW）、血肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）等的检测。3.应用过碘酸-希夫（PAS）染色观察各组大鼠肾组织病理改变。4.应用硫代巴比妥酸法检测各组大鼠的血和尿丙二醛（MDA）的含量,应用黄嘌呤氧化酶法检测各组大鼠的血和尿的总超氧化物岐化酶（SOD）的活性。5.应用氯胺T法检测各组大鼠肾皮质的羟脯氨酸（HYP）含量。6.应用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测各组大鼠肾皮质p47phox和核因子相关因子2（Nrf2）的mRNA表达。7.应用免疫印迹（Western blot）法检测各组大鼠肾皮质磷酸化肌醇需求激酶1α（p-IRE1α）、p47phox、硝基酪氨酸（NT）和Nrf2的蛋白表达。8.应用凝胶电泳迁移率（EMSA）法检测各组大鼠肾皮质核转录因子κB（NF-κB）的活化情况。二、体外实验1.将培养的RMCs分为NC组、高糖组（HG组）和HG+4-PBA组。NC组予以10%胎牛血清（FBS）+RPMI 1640培养基,HG组予以30 mmol/L葡萄糖培养基,HG+4-PBA组予以30 mmol/L葡萄糖+5 mmol/L 4-PBA培养基。在干预开始后分别于12、24和48 h采用MTT法测定细胞增殖活性。2.应用硫代巴比妥酸法检测各组RMCs培养上清液的MDA含量,应用黄嘌呤氧化酶法检测各组RMCs培养上清液的总SOD活性。3.应用氯胺T法检测各组RMCs培养上清液的HYP含量。4.应用RT-PCR法检测各组RMCs的p47phox和Nrf2的mRNA表达。5.应用Western blot法检测各组RMCs的p-IRE1α、p47phox、Nrf2和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的蛋白表达。结果一、DN大鼠肾脏病理改变的动态观察1.DN大鼠UPER、肾质量指数（KI）、BG、肾功能和肾皮质HYP含量的动态变化与同一时相点NC组大鼠比较,DN组大鼠的UPER、KI、BG、SCr、BUN和肾皮质的HYP含量在各时相点均显著升高（均P<0.05）;其中UPER、KI、SCr、BUN和肾皮质HYP含量均在12周时达最高峰。这些结果提示,随着时间进展,大鼠DN呈进行性发展。2.DN大鼠肾脏动态病理改变在干预开始后第4周时,DN大鼠肾小球和肾小管病变不明显。第8周时,DN大鼠肾脏开始出现轻度肾小球肥大、肾小球基底膜增厚、局灶性的系膜增生、系膜基质增多、系膜区轻度增宽等。第12周时,DN大鼠表现出典型的肾脏病理改变,包括系膜细胞明显增生、系膜区增宽、基底膜增厚和系膜基质积聚等。结果提示,随着时间进展,DN大鼠肾脏病理改变呈进行性加重。二、DN大鼠肾皮质p-IRE1α的蛋白表达动态变化与NC组比较,在第4、8和12周时,DN组大鼠肾皮质p-IRE1α的蛋白表达均显著升高（均P<0.05）。与4周时的DN组比较,8和12周时DN组大鼠肾皮质p-IRE1α的蛋白表达显著升高（均P<0.05）;与8周时的DN组比较,12周时DN组大鼠肾皮质p-IRE1α的蛋白表达显著升高（均P<0.05）。这些结果提示,随着时间的进展,DN大鼠肾脏ERS的强度呈进行性增强的趋势。三、DN大鼠肾皮质氧化应激标志物表达的动态变化与NC组大鼠比较,DN组大鼠肾皮质的p47phox和Nrf2的mRNA和蛋白表达在各时相点均显著升高（均P<0.05）,NT的蛋白表达也在各时相点显著升高（均P<0.05）;与NC组比较,在各时相点,DN组大鼠的血清和尿的MDA含量均显著升高（均P<0.05）,而SOD活性则显著下降（均P<0.05）。这些结果提示氧化应激水平在DN大鼠肾皮质显著升高。四、4-PBA对DN大鼠肾皮质p-IRE1α蛋白表达的影响与DN组比较,在第8和12周末时,DN+4-PBA组大鼠肾皮质的p-IRE1α的蛋白表达显著下降（均P<0.05）,在12周时表达最低（P<0.05）,提示4-PBA能有效下调DN大鼠肾皮质ERS的强度。五、4-PBA抑制DN大鼠肾脏病变的发生发展1.4-PBA对DN大鼠UPER、KI、BG、肾功能和肾皮质HYP含量的影响与DN组比较,DN+4-PBA组大鼠的UPER、KI和肾皮质HYP含量在各时相点均显著下降（均P<0.05）,BG则在第8和12周末显著下降（均P<0.05）,而SCr和BUN则无明显改变。这些结果表明,4-PBA能有效减少DN大鼠尿蛋白排泄、降低BG、抑制DN大鼠的肾脏肥大和纤维化,提示利用4-PBA调节ERS强度对大鼠DN有显著的治疗作用。2.4-PBA抑制DN大鼠肾脏病理改变在干预开始后第4周时,各组大鼠肾小球和肾小管病变不明显。在第8周和12周时,DN+4-PBA组大鼠肾脏病理较DN组明显减轻,包括肾小球代偿性肥大减轻、系膜增生明显减轻、系膜区增宽明显下降、基底膜增厚和系膜基质积聚明显减少等,提示4-PBA治疗能显著改善DN大鼠的肾脏病理变化。六、4-PBA抑制DN大鼠肾皮质氧化应激与DN组比较,DN+4-PBA组大鼠肾皮质的p47phox mRNA和蛋白表达,以及Nrf2的mRNA表达在第8和12周显著下降（均P<0.05）,而Nrf2和NT的蛋白表达在各时相点均显著下降（均P<0.05）;与DN组比较,DN+4-PBA组大鼠的血清和尿的MDA含量在各时相点均显著下降（均P<0.05）,而SOD活性则显著上升（均P<0.05）。这些结果提示,通过利用4-PBA调节ERS强度,能显著抑制大鼠体内和肾皮质的氧化应激。七、4-PBA抑制DN大鼠肾皮质NF-κB的活性在第12周时,与NC组比较,DN组大鼠肾皮质的NF-κB活性显著升高（P<0.05）;与DN组比较,DN+4-PBA组大鼠肾皮质的NF-κB活性显著下降（P<0.05）。结果提示,利用4-PBA调节ERS强度,能显著抑制DN大鼠肾皮质的NF-κB活性。八、4-PBA抑制高糖诱导的p-IRE1α蛋白表达与NC组比较,HG组的RMCs的p-IRE1α蛋白表达在各时相点均显著升高（均P<0.05）,并呈时间依赖性,提示ERS在高糖刺激的RMCs显著激活,且强度随时间进展呈进行性增强的趋势（均P<0.05）;与HG组比较,在第24和48 h,HG+4-PBA组RMCs的p-IRE1α的蛋白表达显著下降（均P<0.05）,提示4-PBA能有效下调高糖刺激的RMCs的ERS强度。九、4-PBA抑制高糖诱导的氧化应激与NC组比较,在第12、24和48 h,HG组RMCs的p47phox和Nrf2的mRNA和蛋白表达均显著升高（均P<0.05）;与NC组比较,在各时相点,HG组RMCs培养上清液的MDA含量均显著升高（均P<0.05）,而SOD活性则显著下降（均P<0.05）。这些结果提示氧化应激水平在高糖刺激的RMCs显著升高。与HG组比较,HG+4-PBA组RMCs的p47phox mRNA和蛋白表达,以及Nrf2的mRNA表达在第8和12周均显著下降（均P<0.05）,而Nrf2和NT的蛋白表达在各时间点均显著下降（均P<0.05）;与HG组比较,HG+4-PBA组RMCs培养上清液的MDA含量均显著下降（均P<0.05）,而SOD活性则显著上升（均P<0.05）。这些结果提示,通过利用4-PBA调节ERS强度,能显著抑制高糖刺激的RMCs的氧化应激。十、4-PBA抑制高糖诱导的α-SMA蛋白表达和细胞增殖,减少HYP含量与NC组比较,在各时相点,HG组RMCs的α-SMA蛋白表达、增殖活性和细胞培养上清液的HYP含量均显著升高（均P<0.05）;与HG组比较,HG+4-PBA组RMCs的α-SMA蛋白表达、增殖活性和细胞培养上清液的HYP含量在各时相点均显著降低,其中细胞增殖率与NC组在12和24h的差异无统计学意义。提示4-PBA干预可明显抑制高糖刺激诱导的RMCs表型转化、增殖活性和纤维化程度。结论一、ERS在DN大鼠肾皮质和高糖刺激的RMCs显著激活,其强度随时间进展而进行性增强,是大鼠DN发生发展的重要病理机制。二、ERS通过调控氧化应激和炎症激活参与DN发病过程。三、利用化学分子伴侣4-PBA调控ERS的强度,能显著抑制DN大鼠肾皮质的氧化应激和炎症激活,有效控制DN的进展。

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• 论文正文 内质网应激偶联氧化应激信号通路在糖尿病肾病发病中的作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 内质网应激偶联氧化应激与糖尿病肾病
• 参考文献
• 硕士期间发表的文章