论文摘要
目的:EC作为血管基本的结构和功能单位,其重要的生理功能就是发挥其屏障功能,调节血管内外的物质交换,维持内环境的稳定,使得邻近或远端的组织器官免受损害。细胞外基质与EC粘附形成完整的内皮屏障。在PF的发病过程中,起始阶段的肺泡炎和纤维化形成阶段均有血管通透性增高、EC间连接持续开放。这种内皮屏障功能的异常为大分子物质跨内皮交换提供了旁路途径,对肺损伤时炎症细胞进入肺泡、肺间质及激活Fb增殖具有重要意义。EC连接蛋白与肌动蛋白相连,与细胞骨架一起受细胞内[Ca2+]i的影响。本实验通过电镜、细胞培养、免疫组化、激光共聚焦扫描技术,观察肺炎及PF大鼠PMVEC形态学改变,比较PF及正常大鼠PMVEC内[Ca2+]i差异,并分析其负反馈调节因素—中电导钙激活钾通道蛋白质1（Kca3.1）的表达特点,探讨博莱霉素损伤时大鼠肺PMVEC屏障功能变化和机制以及PMVEC在PF发生中的地位和作用。方法:SD大鼠20只,体重150±20 g,雌雄不拘（第四军医大学实验动物中心）。随机分为对照组和博莱霉素组（BLM组）,每组各10只。博莱霉素A5（天津太河制药,8mg/支,批号041103）用生理盐水稀释成4 g/L,按5 mg/kg体重气管内滴入0.150.2 ml制作PF模型,对照组气管内滴入等量生理盐水。两组分别行PMVEC原代培养,以100μL Fluo-3 /AM荧光指示剂（美国Molecular Probe公司）负载,激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内[Ca2+]i荧光强度,应用免疫细胞化学法及免疫荧光法分别测定Kca3.1在EC的表达。透射电镜观察肺炎、BLM组及对照组PMVEC形态（电镜标本由第四军医大学唐都医院放射科殷茜博士提供）。结果:1.肺微血管内皮细胞透射电镜观察①.EC紧密连接:对照组EC管腔面光滑,没有镧颗粒附着,紧密连接未见开放。肺炎7 d组EC腔面有少量絮状镧颗粒,紧密连接开放,EC呈增生状态。肺炎14 d组恢复光滑表面,未见镧颗粒附着,EC恢复正常状态,EC周围有少量胶原沉积。BLM各组紧密连接持续开放,EC腔面可见絮状、线状镧颗粒及血小板附着。EC表面不光整,可见指状突起,EC呈增生状态,以7d、14 d、21 d组明显。②.EC吞饮小泡:肺炎7 d组EC内吞饮小泡明显减少,而BLM各组吞饮小泡均较丰富,特别是BLM 7 d组,胞质中出现大量吞饮小泡,且体积增大。EC旁可见较多胶原沉积,局部EC与Fb直接接触。2.肺微血管内皮细胞内游离Ca2+主要位于细胞浆。内皮细胞[Ca2+]iBLM组（166.56±24.17）明显高于对照组（95.79±13.51,p<0.01）,两者比较差异具有统计学意义3.肺微血管内皮细胞Kca3.1主要表达在细胞膜上。间接免疫荧光法BLM组Kca3.1（679.29±206.98）明显低于对照组（958.75±188.84,p<0.01）;免疫细胞化学法BLM组Kca3.1（169.08±14.81）明显低于对照组（189.78±13.73,p<0.01）,两者比较差异具有统计学意义。结论:1.血管通透性增高、EC粘附性增加及EC转运功能增强提示BLM组PMVEC的血管屏障功能发生异常,是炎症细胞及血管活性物质进入组织间的重要因素之一。2. EC内钙过载是PMVEC屏障功能异常的重要原因,EC[Ca2+]i过载与EC表型转换及EC功能变化密切相关。3. PMVEC细胞膜中电导钙激活钾通道蛋白质1活性下降是EC钙过载的原因之一。
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标签：纤维化论文; 肺微血管内皮细胞论文; 内皮屏障论文; 中电导钙激活钾通道蛋白质论文;