论文摘要
牛乳是引起食物过敏的八大类常见食物之一。据报道,牛乳过敏引发的病症在婴幼儿中尤为常见,1岁以下婴幼儿中的发生率约为2-3%。因此,开展牛乳过敏的研究对于提高牛乳过敏人群生活质量具有重要的的现实意义。另外,由于表位是食物过敏反应的物质基础,所以表位定位是牛乳过敏研究的一个核心问题,也是人们认识食物过敏的首要任务。本文以过敏原蛋白质β-酪蛋白为研究对象,从鲜牛乳中分离纯化β-酪蛋白、制备特异性多克隆抗体、亲和纯化多克隆抗体、建立β-酪蛋白构象模型、最终定位出β-酪蛋白的构象性表位,主要的研究工作和结论如下。1.采用等电点沉淀法从鲜牛乳中得到酪蛋白,冷冻干燥后的酪蛋白粉末经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离后,得到了β-酪蛋白。经过SDS-PAGE电泳和等电聚焦电泳鉴定,结果表明,获得了纯度高于90%的β-酪蛋白。2.采用分离纯化的β-酪蛋白免疫日本大白耳兔,制备兔抗牛乳β-酪蛋白多克隆抗体,免疫过程中利用间接ELISA方法监测免疫效价的变化,最终得到效价分别为1：240,000和1：150,000的抗血清各一份。3.利用溴化氰活化的Sepharose4B对抗8-酪蛋白兔血清进行亲和纯化,经SDS-PAGE电泳检测,结果显示纯化后抗体在泳道中基本上只显示出重链（55Kda）和轻链（22Kda）2条带,纯化效果较好；同时对纯化后抗体进行间接ELISA效价测定,A、B两兔的血清效价分别从亲和纯化上样前的100,000和70,000上升到纯化后的120,000和80,000,表明经过亲和纯化,得到了高纯度和高特异性的多克隆抗体。4.分别利用同源建模、折叠识别法建模、从头预测方法对β-酪蛋白结构模型进行构建,并对所建模型进行逐级开放式优化和Ramanchandran plot、WHATCHECK、ERRAT等方法评估,选择最优模型,结果得到经同源建模并经过优化后的模型为最终的β-酪蛋白结构模型；以文献报道的针对β-酪蛋白空间构象的实验数据作为参照,将所建模型与Kumosinski等人的p-酪蛋白典型模型进行比较,评价本研究工作中建模结果的准确性,结果显示,与Kumosinski等人所建模型相比,本实验所建模型更能与β-酪蛋白空间构象的实验数据吻合。5.通过噬菌体肽库筛选得到了用于β-酪蛋白构象性表位定位的6个模拟肽；同时通过搜索得到晶体结构已解析的抗原抗体的复合物,并提取其中的表位信息,形成数据信息库,然后对该库进行统计分析,得到表位覆盖面积大小、表位氨基酸数目、不同种类表位氨基酸残基的出现频率、表位中起间隔作用的氨基酸残基类型和出现频率以及表位氨基酸残基在不同蛋白质二级结构中出现频率等信息；所得信息结合噬菌体肽库筛选结果,最终定位出β-酪蛋白的4个构象性表位。
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摘要ABSTRACT目录第1章 引言1.1 牛乳过敏1.1.1 牛乳过敏机理1.1.2 牛乳中的主要过敏原1.1.3 牛乳过敏的危害1.2 牛乳过敏原的安全管理1.2.1 牛乳过敏的检测1.2.1.1 血液检测1.2.1.2 血液检测1.2.1.3 食物激发试验1.2.2 牛乳过敏原的管理1.2.2.1 IgE介导的牛乳过敏的管理1.2.2.2 非IgE介导的牛乳过敏的管理1.2.2.3 针对不同过敏症状的牛乳过敏的管理1.2.2.4 食物避免与营养的管理1.2.2.5 食物过敏原标签管理1.3 牛乳中的酪蛋白1.3.1 酪蛋白胶束1.3.2 牛奶酪蛋白的结构与理化性质1.3.2.1 αs1-酪蛋白s2-酪蛋白'>1.3.2.2 αs2-酪蛋白1.3.2.3 β-酪蛋白1.3.2.4 κ-酪蛋白1.4 β-酪蛋白的构象性表位1.5 研究内容及意义第2章 牛乳中β-酪蛋白的分离纯化2.1 材料与设备2.1.1 试剂与材料2.1.2 设备2.1.3 溶液配制2.2 实验方法2.2.1 鲜牛奶脱脂2.2.2 等电点沉淀酪蛋白2.2.3 β-酪蛋白预处理2.2.4 β-酪蛋白分离纯化2.2.5 蛋白质及其纯度鉴定2.2.5.1 SDS-PAGE鉴定2.2.5.2 IEF-PAGE鉴定2.2.6 蛋白质浓度鉴定2.3 实验结果2.3.1 β-酪蛋白的分离纯化2.3.2 蛋白质及其纯度鉴定2.3.3 浓度鉴定2.4 讨论2.4.1 β-酪蛋白的离子交换层析条件选择2.4.2 蛋白质鉴定和浓度鉴定2.5 小结第3章 抗牛乳β-酪蛋白多克隆抗体的制备及亲和纯化3.1 材料与设备3.1.1 试剂3.1.2 仪器与耗材3.1.3 溶液配制3.2 实验方法3.2.1 多克隆抗体的制备3.2.2 抗体滴度测定的方正滴定3.2.3 间接ELISA测定抗体效价3.2.4 抗血清的制备3.2.5 亲和层析纯化特异性兔IgG3.2.5.1 血清的预处理3.2.5.2 亲和层析柱的制备3.2.5.3 亲和纯化3.2.5.4 抗体SDS-PAGE纯度鉴定3.2.5.5 间接ELISA测定抗体效价3.3 实验结果3.3.1 ELISA方法的条件确立及其对效价变化的监测3.3.2 亲和层析纯化特异性IgG3.3.2.1 血清的获取3.3.2.2 偶联效果的检测3.3.2.3 非特异性洗脱过程中蛋白质含量监测3.3.2.4 特异性洗脱过程中蛋白质含量监测3.3.2.5 浓缩除盐3.3.2.6 纯化前后抗体效价的比较3.3.2.7 纯化后样品的SDS-PAGE电泳图3.4 讨论3.4.1 佐剂的选择3.4.2 试验动物的选择3.4.3 多克隆抗体的制备和储存3.4.4 多克隆抗体的亲和纯化3.4.4.1 配基及载体的选择3.4.4.2 层析条件的选择3.5 本章小结第4章 β-酪蛋白结构模型的构建4.1 实验材料4.2 实验原理和方法4.2.1 蛋白质结构建模4.2.1.1 同源建模4.2.1.2 折叠识别法4.2.1.3 从头预测法4.2.2 模型优化与选择4.2.3 模型检验4.3 结果4.3.1 同源建模结果4.3.2 折叠识别法建模结果4.3.3 从头预测法建模结果4.3.4 模型评估及β-酪蛋白最优模型的确立4.4 讨论4.5 本章小结第5章 β-酪蛋白构象性表位的定位5.1 材料与设备5.1.1 试剂与材料5.1.2 仪器5.1.3 试剂配方5.2 实验方法5.2.1 噬菌体展示技术对IgG表位的筛选5.2.2 构象性表位参数的确立5.2.2.1 表位数据集的获取5.2.2.2 表位性质的统计学分析5.2.3 构象性表位的定位5.3 实验结果5.3.1 噬菌体展示技术筛选表位模拟肽5.3.2 表位信息数据库的获取5.3.3 表位性质的统计学分析结果5.3.3.1 表位氨基酸数目5.3.3.2 表位氨基酸类型5.3.3.3 表位大小5.3.3.4 表位间隔氨基酸5.3.3.5 表位氨基酸所在二级结构5.3.4 β-酪蛋白IgG表位的定位5.4 讨论5.5 本章小结第6章 研究结论与展望6.1 结论6.2 展望致谢参考文献
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