论文摘要
丝氨酸蛋白酶（serine proteinases,SPs）广泛分布于昆虫中,当机体受到病菌侵染,胞外丝氨酸蛋白酶水解级联反应会激活机体Toll途径以及血淋巴黑化反应的关键酶,从而诱使机体产生抗菌肽、醌等细胞毒素物质来消灭入侵物。菜粉蝶Pieris rapae（鳞翅目Lepidoptera:粉蝶科Pieridae）是世界性十字花科重要蔬菜害虫,蝶蛹金小蜂Pteroma luS puparum（膜翅目Hymenoptera:金小蜂科Pteromal idae）是菜粉蝶蛹期优势寄生蜂,其毒液能通过抑制丝氨酸蛋白酶级联反应从而阻止寄主先天免疫反应。为阐明丝氨酸蛋白酶在菜粉蝶免疫中的作用以及蝶蛹金小蜂毒液对丝氨酸蛋白酶活性的抑制机理,本文克隆了菜粉蝶蛹期脂肪体和血细胞中丝氨酸蛋白酶基因cDNA,对其组织分布、不同生长发育阶段分布、转录和表达模式作了研究。1)克隆了菜粉蝶4种丝氨酸蛋白酶基因全长cDNA,并对其序列特征进行了分析。通过简并引物RT—PCR克隆了7个丝氨酸蛋白酶家族基因的cDNA片段,大小均在450 bp左右。采用末端快速扩增法（rapid-amplification of cDNA ends, RACE）扩增获得4条cDNA的全序列,所克隆了4条全长cDNA序列命名为Pr-SP1、Pr-SP2、Pr-SP3、Pr-SP4,长度分别为1489、1794、1491、1330 bp,开放阅读框长度分别为1059、1230、1245、1206 bp。序列特征分析发现Pr-Sp1、Pr-SP2、Pr-SP3、Pr-SP4均含有信号肽,C端都包含有完整的催化三联体,Pr-SP1在N端还有一个发夹结构域。多序列比对结果表明,这4种蛋白酶基因与其他昆虫的同源基因存在较高相似性。2)明确了4个蛋白酶基因在菜粉蝶组织中的分布。注射大肠杆菌1 h后解剖菜粉蝶蛹,提取不同组织的mRNA,并收集总蛋白,对Pr-SP1、Pr-SP2、Pr-SP3、Pr-SP4的转录和表达水平分别进行检测,结果发现Pr-SP1、Pr-Sp2主要在颗粒血细胞内发生转录,其表达产物集中在血浆,脂肪体也有少量分布；Pr-SP3转录主要发生在浆血细胞内,其表达产物集中在血浆；Pr-SP4在各个组织中都有转录,其表达产物则集中在血浆。3)明确了4个蛋白酶基因在菜粉蝶的不同生长发育阶段转录和表达水平。对免疫诱导后的菜粉蝶卵,1龄、3龄、5龄幼虫以及蛹Pr-SP1、Pr-SP2、Pr-SP3、Pr-SP4转录和表达水平进行检验,结果发现Pr-SP1、pr-SP2具有相似的变化趋势,在各个阶段都有转录和表达,卵期水平最低,5龄幼虫最高,从5龄幼虫到蛹其转录和表达水平则显著下降；Pr-SP3在卵期转录水平极低,未见明显表达,幼虫期转录水平随着龄期增大而提高,从5龄幼虫到蛹其转录和表达水平显著下降；Pr-SP4在卵期转录水平极低,未见明显表达,幼虫期水平变化不明显,从5龄幼虫到蛹其转录和表达水平显著提高。4)明确了不同诱导物及诱导时间对4个蛋白酶基因转录和表达水平的影响。在菜粉蝶蛹内注射微珠、大肠杆菌E.coli、巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris和藤黄微球菌Micrococcus luteus,以注射PBS为对照,结果发现经大肠杆菌,巴斯德毕赤酵母和藤黄微球菌诱导,与对照相比Pr-SP1转录和表达水平明显上升。微珠在所有时间点都不能诱导Pr-SP1转录和表达；微珠会在免疫反应的初期（1h）诱导Pr-SP2转录和表达,而大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母和藤黄微球菌则在8 h和24 h时诱导其转录和表达；微珠、大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母和藤黄微球菌会在不同的时间诱导Pr-SP3转录和表达,其中注射大肠杆菌后8 h的个体Pr-SP3转录水平远高于其他个体；免疫诱导后1 h,注射微珠、大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母和藤黄微球菌的个体Pr-SP4转录水平与对照相比都有显著增加,此后（8 h、24 h）,其转录水平均有所回落。说明这四个丝氨酸蛋白酶可能参与了不同先天免疫反应。5)明确了蝶蛹金小蜂毒液或寄生对4个蛋白酶基因转录和表达水平的影响。在菜粉蝶蛹内注射微珠、微珠与毒液的混合物以及活体寄生,以注射PBS为对照,结果表明注射微珠后Pr-SP1转录和表达仍然与对照相当,毒液对其也无抑制作用；注射微珠后1 h,Pr-SP2、4转录和表达水平显著高于对照。而当毒液和微珠同时存在或活体寄生时,Pr-SP2、pr-SP4转录和表达相比单独注射微珠的个体显著降低,与对照相当；注射微珠后8 h,Pr-SP3转录水平显著高于对照。而当毒液和微珠同时存在或活体寄生时,Pr-SP3转录和表达未受到抑制,与注射微珠的个体相当。Pr-SP2、Pr-SP4可能参与了寄主抵御寄生的免疫反应,其转录和表达受到毒液的调控。以上结果表明Pr-SP1、Pr-SP2、Pr-SP3、Pr-SP4参与了菜粉蝶的先天免疫,其中Pr-SP2、Pr-SP4转录和表达水平受蝶蛹金小蜂寄生调控,这既为深入研究菜粉蝶丝氨酸蛋白酶的生物学功能奠定基础,也有望为研发针对昆虫丝氨酸蛋白酶的害虫免疫抑制剂提供候选靶标。
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