口蹄疫重组蛋白疫苗的计算机辅助设计及功能研究

论文摘要

口蹄疫（ Foot and mouth disease , FMD ）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一种急性高度传染性的疾病。由于其具有高度传染性和对农业经济的重大影响,国际兽医局（OIE）将口蹄疫列为A类传染病。虽然接种口蹄疫灭活疫苗是预防和控制FMD爆发流行的有效手段,但因其在生产时易造成病毒泄漏,病毒灭活不全,有病毒扩散的隐患,促使我们寻求一种安全有效的疫苗来替代它,重组蛋白疫苗无疑是很好选择。随着计算机技术的发展,表位预测、蛋白质结构预测使疫苗的设计有据可循。我们运用计算机技术设计了AsiaⅠ型口蹄疫疫苗RA2,并用基因工程的手段构建了重组牛AsiaⅠ型口蹄疫疫苗RA2的编码基因,在大肠杆菌中表达,并检验了该重组疫苗的免疫效果。免疫豚鼠的实验表明,RA2疫苗在豚鼠体内可诱生高水平的抗AsiaⅠFMDV的中和性抗体。攻毒实验表明,RA2疫苗免疫的牛有3/5得到了保护,提示RA2可能成为抗牛AsiaⅠ型口蹄疫病毒的有效疫苗。综上所述,采用计算机辅助设计,可以以较少的工作量构建出免疫效果较好的疫苗。

论文目录

• 提要
• 引言
• 材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 试剂
• 1.2 引物由上海生工生物工程有限公司合成
• 1.3 质粒与菌株
• 1.4 细胞株和实验动物
• 1.5 培养基
• 2. 实验方法
• 2.1 通过计算机进行表位分析和疫苗设计
• 2.2 用PCR 搭建的方法构建基因片段A、B
• 2.3 基因片段A、B 的亚克隆
• 2.3.1 酶切片段的回收
• 2.3.2 线性化的载体碱性磷酸化
• 2.3.3 连接反应
• 2.3.4 感受态细胞的制备
• 2.3.5 重组质粒的转化
• 2.3.6 重组质粒的提取与鉴定
• 2.4 RA2 的表达与纯化
• 2.4.1 诱导RA2 表达及用WesternBlot 鉴定
• 2.4.2 超声裂菌鉴定RA2 表达形式
• 2.4.3 SDS－PAGE 电泳
• 2.4.4 尿素变性裂解包涵体
• 2.4.5 RA2 的纯化
• 2.4.6 RA2 的稳定性观察
• 2.5 功能实验
• 2.5.1 RA2 免疫动物实验
• 2.5.1.1 RA2 免疫豚鼠程序
• 2.5.1.2 RA2 疫苗免疫牛程序
• 2.5.2 RA2 疫苗免疫动物血清ELISA 检测
• 2.5.3 RA2 疫苗免疫动物血清细胞中和实验
• 2.5.4 RA2 疫苗免疫动物血清乳鼠中和实验
• 2.5.5 牛体攻毒实验
• 实验结果
• 1. 计算机辅助疫苗设计与结构预测
• 1.1 模板毒株的确定
• 1.2 抗原表位的确定
• 1.3 RA2 结构的确定
• 2. A、B 基因片段的构建
• 3. PET28A-RA2 表达质粒的构建
• 4. RA2 的表达及表达方式鉴定
• 5. RA2 的纯化及稳定性观察
• 6. RA2 的功能实验
• 6.1 RA2 在豚鼠体内诱生牛AsiaⅠ型FMDV 特异性抗体的作用
• 6.1.1 RA2 免疫豚鼠血清中特异性抗体ELISA 检测
• 6.1.2 RA2 免疫豚鼠血清中特异性中和抗体对细胞的保护作用
• 6.1.3 RA2 免疫豚鼠血清中特异性中和抗体对乳鼠的保护作用
• 6.2 RA2 刺激牛产生特异性抗体及诱导保护性免疫的作用
• 6.2.1 RA2 免疫牛血清中特异性抗体ELISA 检测
• 6.2.2 RA2 免疫豚鼠血清中特异性中和抗体对细胞的保护作用
• 6.2.3 RA2 免疫牛血清中特异性中和抗体对乳鼠的保护作用
• 6.2.4 牛体攻毒实验
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢