论文摘要
猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）有2种基因型即PCV1和PCV2，其中PCV1广泛存在于猪源肾细胞中，但不引起感染猪发病，而PCV2是近年来新发现的引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（post weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）的必需病原，还与猪繁殖障碍（reproductive failure）、猪皮炎与肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS）和呼吸道疾病综合征（porcinerespiratory disease syndrome, PRDS）有关，这些疾病的流行给世界养猪业带来巨大的经济损失，更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他病原的继发感染。PCV1和PCV2的基因组均含有两个主要的阅读框，即ORF1和ORF2。病毒的主要结构蛋白（Cap蛋白）均由ORF2编码，PCV1的ORF1基因编码Rep和Rep′两种与复制相关的蛋白，PCV2 ORF1基因的编码产物功能尚不十分清楚．本实验利用基因重组技术将PCV2 ORF1基因克隆至原核和真核表达系统，制备获得了重组Rep蛋白，主要内容包括：1．猪圆环病毒2型ORF1基因在大肠杆菌中的表达：以含有PCV2全基因组的pMD-18T-PCV2 SH重组质粒为模板，参照已发表的PCV2基因组序列，设计1对引物，PCR扩增出全长的ORF1基因，并在其上下游添加了EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位点，PCR产物用EcoRⅠ和NotⅠ酶切后与经同样处理的pGEX-6p-1原核表达载体质粒连接，转化DH5a细胞后挑取阳性克隆，经酶切鉴定和测序验证后，于E. coli BL21中用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE分析表明ORF1基因在大肠杆菌中得到表达，重组蛋白大小约为62kDa，测定目的蛋白浓度后，免疫清洁级小鼠，制备出针对非结构蛋白Rep的抗体。2．猪圆环病毒2型ORF1基因在昆虫杆状病毒中的表达鉴定：根据PCV2 ORF1的基因序列设计两条引物从pMD-18T-PCV2 SH重组质粒中扩增出全长的ORF1基因，利用XhDⅠ和KpnⅠ双酶切位点，将ORF1基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中，获得重组转移载体pFBD-ORF1，再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中，经蓝白菌落筛选获得含有ORF1基因的重组穿梭载体rBacmid-ORF1，经脂质体介导转染昆虫细胞sf9，获得重组杆状病毒rAc-Rep，SDS-PAGE和Western-Blotting分析可见大小约为36kDa的特异性条带，表明rAc-Rep在sf9中成功表达了PCV2 Rep蛋白．综上所述，本试验利用大肠杆菌表达系统和昆虫杆状病毒表达系统分别表达了PCV2的ORF1基因，为进一步研制对该病毒感染行之有效的检测试剂奠定了基础．