固定化腈水解酶选择性氧化R-扁桃腈的研究

论文摘要

在pH7.0条件下利用膜分离组件处理腈水解酶粗品,并添加0.5%蔗糖作为冻干保护剂冻干,得到纯化的腈水解酶,其酶活为69U。结合葡聚糖凝胶层析和SDS-PAGE电泳可知纯化的腈水解酶是分子量为21190Da的寡酶,该酶催化R,S-扁桃腈的最佳条件是:pH 9.6,酶与底物的质量比为7:10,温度40℃,实验发现甲苯-水组成的两相反应大大提高了酶的催化效率,且甲苯与水最佳体积比为1:10。添加选择性吸附R-扁桃酸的717树脂有利于转移生成的R-扁桃酸,导致转化率的提高。以D155树脂为基体,通过二环己基碳二亚胺与赖氨酸缩合,制备出L-D155树脂,再以L-D155树脂为载体,通过戊二醛分别与载体和腈水解酶形成席夫碱制备固定化腈水解酶。固定化酶红外分析表明D155树脂成功地通过酰胺键接枝了赖氨酸,N-L-D155在1671 cm-1处出现的宽峰也证明腈水解酶通过席夫碱反应被成功固定在L-D155上。腈水解酶的最佳固定化条件为:戊二醛、载体游离氨基与腈水解酶三者的摩尔比为:0.11:1:1.72×10-4,pH 5.25,该条件下制备的固定化腈水解酶活力为10 15U,Km值为23.11mmol/L,偶联率为43.2%,其热稳定性有所提高,且连续使用5次后可保持85%活力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 扁桃酸简介
• 1.1.1 扁桃酸的性质及用途
• 1.1.2 扁桃酸的制备
• 1.1.3 制备光学纯扁桃酸的意义
• 1.2 光学纯扁桃酸的拆分方法
• 1.2.1 膜拆分法
• 1.2.2 结晶拆分法
• 1.2.3 色谱拆分法
• 1.2.4 化学合成法
• 1.2.5 生物催化法
• 1.3 腈水解酶简介
• 1.3.1 腈水解酶的来源及其理化性质
• 1.3.2 腈水解酶的应用
• 1.3.3 腈水解酶选择性水解扁桃腈的机制
• 1.3.4 影响酶活的因素
• 1.4 固定化酶的研究及应用
• 1.4.1 酶的固定化方法
• 1.4.2 固定化酶载体的研究
• 1.5 本课题选题背景和研究意义
• 2 实验原理
• 2.1 扁桃酸和扁桃腈紫外法测定原理
• 2.2 腈水解酶分子量测定
• 2.2.1 葡聚糖凝胶过滤法
• 2.2.2 SDS-PAGE 电泳法
• 2.3 油水双相反应
• 2.4 固定化酶
• 2.5 红外光谱
• 2.6 核磁共振
• 3 实验仪器及试剂
• 3.1 实验仪器
• 3.2 实验试剂
• 4 实验方法
• 4.1 腈水解酶的分离纯化
• 4.1.1 腈水解酶活力的测定
• 4.1.2 膜分离法纯化腈水解酶
• 4.2 SDS－聚丙烯酰胺凝胶
• 4.2.1 试剂的配制
• 4.2.2 操作方法
• 4.3 葡聚糖凝胶柱层析
• 4.3.1 试剂的配制
• 4.3.2 实验操作
• 4.4 单相催化反应
• 4.4.1 底物浓度
• 4.4.2 反应体系的pH
• 4.4.3 反应温度
• 4.4.4 腈水解酶用量
• 4.5 双相催化反应
• 4.5.1 单双相催化效率对比
• 4.5.2 最佳油水相比
• 4.5.3 添加R-扁桃酸对反应的影响
• 4.5.4 添加树脂对反应的影响
• 4.6 固定化腈水解酶的制备
• 4.6.1 大孔树脂接枝赖氨酸衍生物的制备
• 4.6.2 固定化腈水解酶的制备
• 4.6.3 固定化腈水解酶酶学性质的研究
• 4.7 紫外法测定R-扁桃酸的含量
• 4.7.1 试剂的配制
• 4.7.2 标准曲线的绘制
• 4.7.3 样品的测定
• 4.8 产物光学纯度的检测
• 5 实验结果与讨论
• 5.1 腈水解酶的预处理
• 5.1.1 纯化过程的最佳pH
• 5.1.2 冻干保护剂的选择
• 5.1.3 腈水解酶分子量
• 5.2 游离酶制备 R-扁桃酸
• 5.2.1 单相催化反应
• 5.2.2 双相催化反应
• 5.3 固定化酶制备 R-扁桃酸
• 5.3.1 固定化腈水解酶的制备
• 5.3.2 固定化腈水解酶的酶学性质及其表征
• 5.4 产物的表征
• 5.4.1 红外分析
• 5.4.2 核磁共振光谱
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录