AE3基因siRNA表达质粒的构建及对其转染的心肌细胞H9c2的影响

论文摘要

目的:利用RNA干扰（RNAi）技术,以AE3为靶基因,设计构建siRNA表达质粒,进行测序鉴定,并检测该表达质粒对大鼠心肌样细胞系H9c2 AE3基因表达的影响,为进一步研究AE3基因在心肌细胞损伤及保护中的作用奠定基础。方法:1.设计具有短发夹结构的三条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒并进行序列测定。2.转染携带绿色荧光蛋白的pEGFP-N2质粒,荧光显微镜观察检测瞬时转染不同时相的转染效率,选择最佳时相用于后续瞬时转染靶基因表达抑制率的分析。3.利用构建成功的siRNA表达质粒,通过脂质体介导转染H9c2心肌样细胞,并通过RT-PCR、Western blot检测细胞中AE3 mRNA和蛋白的表达。结果:1.重组质粒转化DH5α菌株经氨苄青霉素抗性筛选可见有细菌克隆长出。2.测序鉴定表明重组质粒中含有针对AE3基因的目的序列。3.将pEGFP-N2通过脂质体介导,转染H9c2心肌样细胞,分别于转染24 h、48 h、72 h后在荧光显微镜下观察转染效果,可见H9c2心肌样细胞胞浆内有绿色荧光,其中转染48 h的转染效率82±6%显著高于转染24 h的转染效率43±6% （P<0.01）和转染72 h的转染效率60±7% （P<0.05）。因此,按48 h最佳转染时间转染构建好的siRNA表达质粒。4. RT-PCR检测细胞中AE3 mRNA的表达水平,显示pSilencer-AE3-A可明显降低H9c2心肌样细胞中AE3 mRNA的表达。5. Western blot检测细胞中AE3蛋白的表达量,显示pSilencer-AE3-A,pSilencer-AE3-B,pSilencer-AE3-C转染的H9c2心肌样细胞AE3蛋白表达分别降低61%,48%,25%。结论:1.成功构建AE3基因siRNA表达质粒pSilencer-AE3-A,pSilencer-AE3-B,pSilencer-AE3-C。2.重组质粒pSilencer-AE3-A可明显降低H9c2心肌样细胞AE3基因在mRNA和蛋白水平的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 主要材料及试剂
• 2.2 实验主要仪器和设备
• 2.3 主要试剂的配制
• 2.4 方法
• 2.4.1 干扰目的基因AE3 的重组质粒pSilencer-AE3 系列的构建
• 2.4.2 重组质粒的转化、鉴定
• 2.4.3 心肌样细胞H9c2 的培养
• 2.4.4 心肌样细胞H9c2 的转染
• 2.4.5 RT-PCR 技术检测H9c2 细胞中AE3 的m RNA 含量
• 2.4.6 Western blot 法检测H9c2 细胞中AE3 蛋白的表达
• 2.5 数据处理
• 第三章 结果
• 3.1 载体双酶切鉴定
• 3.2 重组质粒筛选与鉴定
• 3.2.1 氨苄青霉素抗性筛选重组质粒
• 3.2.2 重组质粒测序鉴定
• 3.3 荧光显微镜观察pEGFP-N2 转染结果
• 3.4 转染siRNA 表达质粒对心肌样细胞AE3 表达的影响
• 3.4.1 对H9c2 心肌细胞AE3 mRNA 表达水平的影响
• 3.4.2 对H9c2 心肌细胞AE3 蛋白表达水平的影响
• 第四章 讨论
• 4.1 AE3 蛋白的结构、分布及功能
• 4.2 RNA 干扰技术
• 4.3 本实验的不足之处及展望
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间的研究成果