人类蛋白（SIAH1与PHC2;RIOK3与PAK2）相互作用及功能的初步研究

论文摘要

本论文分为两个部分,第一部分是关于SIAH1与PHC2蛋白相互作用及其互作区域的探索,第二部分是关于RIOK3和PAK2之间的相互作用及功能研究。在论文的第一部分中,我们首先以SIAH1作为诱饵蛋白对人胎肝cDNA文库进行酵母双杂交筛选,得到了一个与其相互作用的蛋白一一PHC2,并通过体内和体外实验验证了SIAH1与PHC2之间相互作用的真实性。为了进一步确认这两个蛋白之间相互作用的具体区域,我们分别构建了SIAH1和PHC2的系列缺失突变体及点突变体,经酵母双杂交和半外源pull-down方法检验,结果发现SIAH1蛋白中富含半胱氨酸（Cysteine）的第129-166位氨基酸区段是它与PHC2蛋白结合所必需的,但可能需要之后肽段的辅助；而PHC2蛋白的第25-31位氨基酸序列在它与SIAH1的结合中发挥着重要的作用。泛素化实验表明,SIAH能够发挥E3连接酶的作用将PHC2泛素化降解,从而影响PHC2在细胞内的表达量。在论文的第二部分中,我们以RIOK3为诱饵蛋白对人胎脑cDNA文库进行酵母双杂交筛选,得到了一个与其相互作用的蛋白——PAK2。利用哺乳动物细胞免疫共沉淀实验,我们在外源过表达水平上验证了RIOK3和PAK2之间的相互作用关系。免疫荧光共定位实验发现,RIOK3可与PAK2共定位于细胞质中。当RIOK3和PAK2共转染细胞时,随着RIOK3表达量的增加,PAK2的表达量则呈下降趋势,推测RIOK3的过表达可以对细胞中PAK2的表达产生抑制作用。同时细胞增殖实验也证明RIOK3能够在一定程度上抑制PAK2对细胞生长的促进作用。关于RIOK3的功能少见报道,而PAK2则在细胞骨架重排、细胞迁移等方面发挥着重要的作用,因此,RIOK3和PAK2的相互作用及在表达上的相关性可能为研究RIOK3的功能提供新的线索。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 SIAH与PHC2的相互作用及其功能研究
• 一、前言
• 二、材料和方法
• 三、实验结果
• 1. 用酵母双杂交方法筛选与SIAH相互作用的蛋白
• 2. SIAH与PHC2相互作用的进一步验证
• 3. SIAH与PHC2相互作用结构域的研究
• 4. SIAH对PHC2表达的影响
• 四、讨论
• 五、小结
• 参考文献
• 第二部分 RIOK3与PAK2的相互作用及其功能研究
• 一、前言
• 二、材料和方法
• 三、实验结果
• 1. RIOK3相互作用蛋白PAK2的获得
• 2. RIOK3与PAK2在哺乳动物细胞内相互作用的验证
• 3. RIOK3和PAK2在细胞内的荧光共定位
• 4. RIOK3对PAK2表达的影响
• 5. CCK-8法检测RIOK3和PAK2对细胞生长的影响
• 四、讨论
• 五、小结
• 参考文献
• 论文总结
• 综述：Ⅰ类P21活化的蛋白激酶（PAKs）的研究进展
• 参考文献
• 研究生期间发表的论文
• 致谢