哈茨木霉生物防治相关蛋白酶的基因克隆及功能研究

论文摘要

哈茨木霉（Trichoderma harzianum）是重要的生物防治菌,能够通过产生水解酶降解植物病原菌的细胞壁,抑制植物病原菌生长,现已开始应用于植物病害的生物防治中。其水解酶的研究对充分发掘哈茨木霉（T. harzianum）的生防潜力有重要意义。以往关于哈茨木霉（T. harzianum）水解酶的研究多集中于几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶,而关于蛋白酶的生物防治功能研究则少有报道。本文以哈茨木霉（T. harzianum）菌丝体时期诱导cDNA文库为基础,利用SMART RACE技术克隆了哈茨木霉（T. harzianum）枯草杆菌蛋白酶基因sl41、ss10及天冬氨酸蛋白酶基因sa76的cDNA序列及DNA序列。cDNA序列提交GenBank ,序列号分别为DQ910533、EF063644和EF063645。通过生物信息学分析手段对cDNA文库进行筛选,获得了哈茨木霉（T. harzianum）天冬氨酸蛋白酶asp83基因的全长cDNA序列,并登录到GenBank中,登录号为EF063643。采用Northern blot方法分析了哈茨木霉（T. harzianum）sl41、ss10、sa76和asp83基因在不同植物病原真菌细胞壁诱导条件下和不同饥饿条件下的表达模式。结果表明尽管4条基因彼此之间表达模式有明显差异（如启动表达时间、诱导表达强度等）,但是都能够被植物病原菌细胞壁强烈诱导表达。5种病原真菌细胞壁和几丁质均能够强烈诱导sl41、ss10基因表达,且表达不受碳源和氮源的调节。sa76基因能够被病原菌细胞壁和几丁质诱导表达,而且表达受碳、氮饥饿调控。asp83基因表达受氮源的负调控,能够被杨树烂皮病菌（Cytospora chrysosperma）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）3种植物病原菌细胞壁诱导表达。说明这些基因可能在哈茨木霉（T. harzianum）生物防治过程中具有重要作用。将克隆到的sl41、ss10、sa76和asp83蛋白酶基因分别构建到带有高效启动子的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达载体pYES2上,并成功转入酿酒酵母（S. cerevisiae）H158菌株中。Northern杂交表明蛋白酶基因在酿酒酵母（S. cerevisiae）转录水平表达,SDS-PAGE电泳检测出现单一条带,大小与预期相符,表明蛋白酶成功分泌到胞外。以酪蛋白为作用底物,通过福林法对转化子发酵液中的蛋白酶进行酶学特性研究。枯草杆菌蛋白酶SL41和SS10酶促反应的最适pH均为8.0,在pH7.59.5的范围内保持着较高的酶活;最适酶促反应温度分别为40℃和50℃,SL41在2530℃范围内对温度变化较敏感;最适酶促反应条件下的酶活分别为19.4U/mL和17.8U/mL。天冬氨酸蛋白酶SA76和ASP83酶促反应的最适pH分别为3.5和4.0,而且它们在pH35的范围内保持着较高的酶活;SA76和ASP83的最适酶促反应温度为分别为45℃和40℃;最适酶促反应条件下的酶活分别为11.8U/mL和4.0U/mL。以5种常见的植物病原真菌,尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯丝核菌（R. solani）、核盘菌（S. sclerotiorum）、链格孢菌（Alternaria alternata）和杨树烂皮病菌（C. chrysosperma）作为供试菌研究哈茨木霉4种离体蛋白酶的生物防治功能。结果表明:4种蛋白酶对5种常见植物病原菌的菌丝生长表现出了不同程度的抑制作用。枯草杆菌蛋白酶SL41和SS10对5种病原真菌均有较强的抑制作用,特别是对尖孢镰刀菌（F. oxysporum ）的抑制效果最为明显,菌丝生长抑制率分别为58.22%和47.38%。天冬氨酸蛋白酶ASP83对立枯丝核菌（R. solani）和杨树烂皮病菌（C. chrysosperma）有抑制作用,对其余3种病原菌则几乎无抑制作用。SA76对5种植物病原真菌的生长均有抑制作用,其中对尖孢镰刀菌（F. oxysporum）表现出明显的抑制作用,菌丝生长抑制率为42.11%。

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Abstract

第1章绪论

1.1 课题研究的目的和意义

1.2 国内外的研究综述

1.2.1 植物病害生物防治的发展动态

1.2.2 生物防治菌哈茨木霉研究现状

1.2.3 蛋白酶基因研究进展

1.2.4 酿酒酵母表达系统

1.3 存在的问题

1.4 课题的来源及主要研究内容

1.4.1 课题来源

1.4.2 主要研究内容

第2章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 培养基

2.1.3 实验药品和工具酶

2.1.4 缓冲液和常用试剂的配制

2.1.5 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 哈茨木霉菌丝培养

2.2.2 哈茨木霉菌丝体总RNA的提取

2.2.3 消化DNA

2.2.4 单链RACE模板的合成

2.2.5 基因组DNA提取方法

2.2.6 生物信息学方法

2.2.7 RACE技术克隆目的基因

2.2.8 蛋白酶在哈茨木霉中的表达模式分析

2.2.9 斑点杂交检测

2.2.10 表达载体构建

2.2.11 酿酒酵母生长曲线的测定

2.2.12 酿酒酵母的转化

2.2.13 酵母转化子的鉴定

2.2.14 Northern印迹杂交检测

2.2.15 SDS-PAGE电泳

2.2.16 酵母转化子蛋白酶活性检测

2.2.17 蛋白酶发酵液对不同植物病原菌生物防治能力的研究

第3章哈茨木霉蛋白酶基因的克隆、序列分析及表达模式研究

3.1 菌丝体总RNA, DNA提取及RACE模板合成

3.1.1 哈茨木霉菌丝体高质量RNA的提取

3.1.2 反转录合成单链3′RACE及5′RACE cDNA模板

3.1.3 哈茨木霉菌丝体高质量DNA提取

3.2 枯草杆菌蛋白酶基因sl41 的克隆及序列分析

3.2.1 利用SMART RACE 获得sl41 全长cDNA序列

3.2.2 sl41 基因DNA序列的克隆

3.2.3 sl41 基因多序列比对

3.2.4 sl41 基因保守区分析及信号肽预测

3.2.5 sl41 基因三级结构分析

3.3 枯草杆菌蛋白酶基因ss10 的克隆及序列分析

3.3.1 利用SMART RACE 获得ss10 全长cDNA序列

3.3.2 ss10 基因DNA序列的克隆

3.3.3 ss10 基因多序列比对

3.3.4 ss10 基因保守区分析

3.3.5 ss10 基因信号肽分析

3.3.6 ss10 基因三级结构分析

3.4 天冬氨酸蛋白酶基因sa76 的克隆及序列分析

3.4.1 利用SMART RACE 获得sa76 全长cDNA序列

3.4.2 sa76 基因DNA序列的克隆

3.4.3 sa76 基因多序列比对

3.4.4 sa76 基因保守区分析

3.4.5 sa76 基因信号肽分析

3.5 天冬氨酸蛋白酶基因asp83 的克隆及序列分析

3.5.1 asp83 基因全长cDNA序列的获得

3.5.2 asp83 基因多序列比对

3.5.3 asp83 基因保守区分析及三级结构预测

3.6 蛋白酶基因在不同诱导条件下的差异表达

3.6.1 sl41 基因在不同诱导条件下的差异表达

3.6.2 ss10 基因在不同诱导条件下的差异表达

3.6.3 sa76 基因在不同诱导条件下的差异表达

3.6.4 asp83 基因在不同诱导条件下的差异表达

3.7 关于蛋白酶基因的克隆、序列分析及表达模式的讨论

3.7.1 RACE技术的应用

3.7.2 功能基因的生物信息学分析

3.7.3 哈茨木霉sl41 基因的克隆及表达规律

3.7.4 哈茨木霉ss10 基因的克隆及表达规律

3.7.5 哈茨木霉sa76 基因的克隆及表达规律

3.7.6 哈茨木霉asp83 基因的克隆及表达规律

3.8 本章小结

第4章哈茨木霉蛋白酶基因酵母表达研究

4.1 酿酒酵母生长曲线

4.2 枯草杆菌蛋白酶基因sl41 酵母表达

4.2.1 sl41 基因酵母表达载体构建及转化

4.2.2 sl41 基因酵母表达Northern杂交检测

4.2.3 sl41 基因酵母表达SDS-PAGE分析

4.2.4 转sl41 基因酵母酶学特性分析

4.3 枯草杆菌蛋白酶基因ss10 酵母表达

4.3.1 ss10 基因酵母表达载体构建及转化

4.3.2 ss10 酵母表达Northern印迹杂交检测

4.3.3 ss10 基因酵母表达SDS-PAGE分析

4.3.4 转ss10 基因酵母枯草杆菌蛋白酶特性分析

4.4 天冬氨酸蛋白酶基因sa76 酵母表达

4.4.1 sa76 基因酵母表达载体构建及转化

4.4.2 sa76 酵母表达Northern印迹杂交检测

4.4.3 sa76 基因酵母表达SDS-PAGE分析

4.4.4 转sa76 基因酵母天冬氨酸蛋白酶酶学特性分析

4.5 天冬氨酸蛋白酶基因asp83 酵母表达

4.5.1 asp83 基因酵母表达载体构建及转化

4.5.2 asp83 酵母表达Northern印迹杂交检测

4.5.3 转asp83 基因酵母天冬氨酸蛋白酶酶学特性分析

4.6 关于哈茨木霉蛋白酶基因酵母表达的讨论

4.6.1 表达系统的选择

4.6.2 影响外源基因表达的因素

4.6.3 蛋白酶酶学性质的分析

4.7 本章小结

第5章哈茨木霉蛋白酶对不同植物病原菌生物防治功能的研究

5.1 枯草杆菌蛋白酶SL41 对五种植物病原菌的生物防治

5.1.1 SL41 对5 种病原真菌菌丝生长的抑制作用

5.1.2 SL41 对5 种病原真菌的拮抗作用

5.2 枯草杆菌蛋白酶SS10 对五种植物病原菌的生物防治

5.2.1 SS10 对5 种病原真菌菌丝生长的抑制作用

5.2.2 SS10 对5 种病原真菌的拮抗作用

5.3 天冬氨酸蛋白酶SA76 对五种植物病原菌的生物防治

5.3.1 SA76 对5 种病原真菌菌丝生长的抑制作用

5.3.2 SA76 对5 种病原真菌的拮抗作用

5.4 天冬氨酸蛋白酶ASP83 对五种植物病原菌的生物防治

5.4.1 ASP83 对5 种病原真菌菌丝生长的抑制作用

5.4.2 ASP83 对5 种病原真菌的拮抗作用

5.5 关于哈茨木霉蛋白酶对几种病原菌生物防治能力的讨论

5.6 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

个人简历

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