嗜热菌HB27的蛋白酪氨酸磷酸酶的折叠研究

论文摘要

本研究从嗜热菌T. thermophilus HB27中克隆了一个新的PTPase基因,并在大肠杆菌中成功地表达了可溶的、具有生物学活性的PTPase;建立了简单可行的纯化流程,获得了这个热稳定的蛋白,并对其生物化学性质和去折叠过程进行了详细的研究。具体实验内容及结论如下：1.利用生物信息学方法,预测PTPase的等电点为5.88,分子量为22.26kDa,其氨基酸出现频率与Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的结果存在一定差异,其中极性氨基酸占了55.8%；预测其疏水性最大值为2.433,最小值为-2.222,其中2-18,82-90和140-145位的氨基酸具有一定的疏水性；氨基酸序列同源性分析发现PTPase与来源于T. thermophilus HB8的Tt1001氨基酸序列100%相似,与大鼠PTPase （AAB23588）的氨基酸序列则只有30.5%的相似性；二级结构预测PTPase存在三种二级结构：α螺旋、β折叠和无规卷曲。进化树分析表明该蛋白在进化过程中分支为两类：微生物PTPase与动植物PTPase.2.以pNPP为底物,研究了不同的pH、温度和离子对PTPase活性的影响,结果显示其最适pH范围为3.6-4.0,最适温度为75℃。30℃和75℃时kcat／Km的值分别为1.77*104M-1·s-1和6.68*105M-1·s-1。Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+和Ni2+对PTPase的活性都有激活作用,其激活能力依次下降；而Zn2+,Cu2+,Cl-和SO42-则表现出抑制效应。结果表明PTPase也许在帮助T. thermophilus HB27适应极端温度和特定的生存环境方面在体内发挥着重要的生理作用。3.脲、盐酸胍和SDS诱导PTPase失活都是可逆的单相反应过程,抑制效应与浓度和时间相关,其IC50值分别为2.65 M、0.24 M和11.27μM；它们均为混合型抑制,在二次作图中前两者表现为直线,而后者为抛物线型。光谱学结果表明脲诱导了PTPase协同性的两态去折叠转变,而低浓度的盐酸胍诱导并稳定了蛋白去折叠中间态；低浓度的SDS诱导了其三级结构的变化和α-螺旋结构的增加,高浓度的SDS稳定了PTPase的二级结构。4.Cu2+和Zn2+均显著地抑制了PTPase的活性,这种抑制与离子浓度和作用时间相关,其IC50值分别为15μM和8.34 mM；动力学研究表明它们均为混合型可逆抑制,失活过程是单相反应过程。光谱学结果表明它们诱导了PTPase的三级结构发生了变化,但并不影响其二级结构。EDTA无法使Cu2+失活的PTPase恢复活性,但添加DTT则能使其活性恢复到其天然态时的40%,推测PTPase活性位点的Cys残基很可能被Cu2+氧化,从而导致其活性丧失和三级结构发生变化。综上,本研究为理解这一新的热稳定性PTPase的耐热机制、折叠机理、结构和功能,并为构建高效耐热的工程菌及其工业化应用提供了一些有用的信息,同时,对以PTPase为药物作用靶标研发其抑制剂类药物,以期治疗与PTPase相关的人类疾病也有一定的参考意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 蛋白酪氨酸磷酸酶
• 1.1.1 磷酸酶的分类及研究进展
• 1.1.2 蛋白酪氨酸磷酸酶概述
• 1.1.3 蛋白酪氨酸磷酸酶家族及其分类
• 1.1.4 蛋白酪氨酸磷酸酶的生理作用
• 1.1.5 蛋白酪氨酸磷酸酶与疾病
• 1.1.6 以蛋白酪氨酸磷酸酶为靶点开发治疗药物
• 1.1.7 蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂研究进展
• 1.2 极端嗜热菌Thermus thermophilus HB27
• 1.3 蛋白质折叠
• 1.3.1 蛋白质折叠研究的概况
• 1.3.2 研究蛋白质折叠常用的技术与方法
• 1.3.3 蛋白质的折叠机理
• 1.3.4 蛋白质的体内外折叠
• 1.3.5 蛋白质的变性与去折叠
• 1.3.6 蛋白质错误折叠与疾病
• 1.4 本文的研究目的和主要内容
• 第2章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 生物信息学分析及预测
• 2.2.2 重组蛋白酪氨酸磷酸酶的克隆、表达和纯化
• 2.2.3 蛋白酪氨酸磷酸酶的活性测定
• 2.2.4 酶促反应动力学常数的测定
• 2.2.5 pH对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响
• 2.2.6 温度对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响
• 2.2.7 金属阳离子和阴离子对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响
• 2.2.8 抑制动力学研究
• 2.2.9 脲、盐酸胍、SDS变性实验
• 2.2.10 内源荧光光谱实验
• 2.2.11 ANS结合荧光光谱实验
• 2.2.12 远紫外圆二色光谱实验
• 第3章 生物信息学分析蛋白酪氨酸磷酸酶的序列和结构
• 3.1 引言
• 3.2 结果
• 3.2.1 蛋白酪氨酸磷酸酶氨基酸序列分析
• 3.2.2 蛋白酪氨酸磷酸酶疏水性分析
• 3.2.3 蛋白酪氨酸磷酸酶的氨基酸序列同源性分析
• 3.2.4 蛋白酪氨酸磷酸酶二级结构的预测
• 3.2.5 蛋白酪氨酸磷酸酶二级和三级结构预测分析
• 3.2.6 蛋白酪氨酸磷酸酶的进化树构建
• 3.3 讨论
• 第4章 重组蛋白酪氨酸磷酸酶:表达,纯化和性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 结果
• 4.2.1 蛋白酪氨酸磷酸酶基因克隆和重组构建
• 4.2.2 蛋白酪氨酸磷酸酶的表达和纯化
• 4.2.3 酶促反应动力学常数
• 4.2.4 pH对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响
• 4.2.5 温度对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响
• 4.2.6 金属阳离子和阴离子对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响
• 4.3 讨论
• 第5章 脲和盐酸胍变性过程中蛋白酪氨酸磷酸酶的失活和去折叠研究
• 5.1 引言
• 5.2 结果
• 5.2.1 脲和盐酸胍对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响
• 5.2.2 脲和盐酸胍对蛋白酪氨酸磷酸酶内源荧光光谱的影响
• 5.2.3 脲和盐酸胍对蛋白酪氨酸磷酸酶ANS结合荧光光谱的影响
• 5.2.4 脲和盐酸胍对蛋白酪氨酸磷酸酶远紫外圆二色光谱的影响
• 5.3 讨论
• 第6章 动力学和结构分析蛋白酪氨酸磷酸酶和SDS的相互作用
• 6.1 引言
• 6.2 结果
• 6.2.1 SDS对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响
• 6.2.2 SDS对蛋白酪氨酸磷酸酶失活动力学的影响
• 6.2.3 SDS对蛋白酪氨酸磷酸酶内源荧光光谱的影响
• 6.2.4 SDS对蛋白酪氨酸磷酸酶ANS结合荧光光谱的影响
• 6.2.5 SDS对蛋白酪氨酸磷酸酶远紫外圆二色光谱的影响
• 6.2.6 序列同源建模和结构分析
• 6.3 讨论
• 2+对蛋白酪氨酸磷酸酶的效应'>第7章 反应动力学和光谱学研究Cu²⁺对蛋白酪氨酸磷酸酶的效应
• 7.1 引言
• 7.2 结果
• 2+对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响'>7.2.1 Cu²⁺对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响
• 2+对蛋白酪氨酸磷酸酶三级结构的影响'>7.2.2 Cu²⁺对蛋白酪氨酸磷酸酶三级结构的影响
• 2+对蛋白酪氨酸磷酸酶二级结构的影响'>7.2.3 Cu²⁺对蛋白酪氨酸磷酸酶二级结构的影响
• 2+失活的蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响'>7.2.4 EDTA和DTT对Cu²⁺失活的蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响
• 7.3 讨论
• 2+对蛋白酪氨酸磷酸酶活性和构象的影响'>第8章 Zn²⁺对蛋白酪氨酸磷酸酶活性和构象的影响
• 8.1 引言
• 8.2 结果
• 2+对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响'>8.2.1 Zn²⁺对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响
• 2+对蛋白酪氨酸磷酸酶内源荧光光谱的影响'>8.2.2 Zn²⁺对蛋白酪氨酸磷酸酶内源荧光光谱的影响
• 2+对蛋白酪氨酸磷酸酶ANS结合荧光光谱的影响'>8.2.3 Zn²⁺对蛋白酪氨酸磷酸酶ANS结合荧光光谱的影响
• 2+对蛋白酪氨酸磷酸酶远紫外圆二色光谱的影响'>8.2.4 Zn²⁺对蛋白酪氨酸磷酸酶远紫外圆二色光谱的影响
• 8.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 在读期间的研究成果
• 致谢