论文摘要
研究目的:1.构建B和C基因型重组乙型肝炎病毒及检测其在Huh7细胞内的复制和表达。2.探讨B和C基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞全基因组表达模式的影响是否相似。3.评价针对重组B和C基因型HBV S区目的小发夹RNAs（shRNAs）在存在错配的情况下对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用,对HBsAg mRNA水平的抑制作用,及对HBV DNA复制的抑制程度。研究方法:1.根据相关文献设计扩增HBV全基因组的引物,分别从感染B和C基因型的患者血清中提取HBV DNA作为模板,应用高保真热启动Taq DNA聚合酶扩增HBV全基因组;2.SacⅠ酶切扩增的全长HBV和pUC19,应用T4 DNA连接酶使HBV插入pUC19上的SacⅠ酶切位点,命名为pUC19-BHBV和pUC19-CHBV;3.应用SapⅠ酶切pUC19-HBV和pHY106真核表达载体,将获得的全长HBV在与线性的pHY106连接,使全长HBV插入pHY106的SapⅠ酶切位点,命名为pHY106-BHBV和pHY106-CHBV;4.将pHY106-BHBV和pHY106-CHBV分别转染Huh7细胞,以pHY106空载体转染作对照;①分别于转染后24h、48h和72h取细胞培养上清,-20℃冻存,用于ELISA检测HBsAg和HBeAg表达;②转染后72h,裂解细胞,提取细胞内HBV核心颗粒内HBV复制中间体,用于Southern blot检测;③转染后72h,用PBS洗细胞5次,裂解细胞,应用Real-time PCR定量检测Huh7细胞内HBV DNA水平。5.基因芯片技术:B或C基因型重组乙型肝炎病毒（即pHY106-BHBV,pHY106-CHBV）转染Huh7细胞,以pHY106空载体为对照,48h后提取细胞mRNA,逆转录为cDNA,与芯片杂交,用GenePix Pro3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度,计算每个基因点在本次实验中的表达差异值Ratio,Ratio=Cy5/Cy3;筛选出Ratio大于2或小于0.5的基因点,这些数据所代表的基因在与两种探针杂交时表现出较大的差异;6.实时定量PCR:pHY106-BHBV,pHY106-CHBV转染Huh7细胞48h,以pHY106空载体为对照,提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,应用实时定量PCR对基因芯片差异表达的部分基因进行验证。7.将shRNAs分别和B或C基因型重组HBV,即pHY106-BHBV和pHY106-CHBV共转染HepG2细胞;于转染后24h、48h、72h、96h和120h分别取细胞培养上清,-20℃冻存,留作ELISA检测HBsAg和HBeAg表达水平;8.shRNAs分别和B或C基因型重组HBV转染HepG2细胞72h后,应用Trizol法提总RNA,逆转录为cDNA,进行RT-PCR,对HBsAg mRNA水平进行半定量检测;于转染后72h,裂解细胞,提取HBV核心颗粒内的HBV复制中间体进行Southernblot实验。结果:1.成功构建了pHY106-BHBV和pHY106-CHBV两个表达载体;2.pHY106-BHBV和pHY106-CHBV转到Huh7细胞后,检测到了HBsAg和HBeAg的表达,HBsAg表达于48h达高峰,HBeAg的表达高峰晚于HBsAg约24h;3.应用Southem blot检测到了细胞内HBV核心颗粒内的HBV复制中间体,包括rcDNA,dsDNA和ssDNA;4.应用Real-time PCR定量检测发现转染到Huh7细胞内的pHY106-BHBV和pHY106-CHBV HBV DNA拷贝数高,于72h达高峰,可达8log10;5.pHY106-BHBV转染Huh7细胞48h后,从4097个基因中筛选出差异表达基因共60条,其中1条基因表达明显增强,59条基因表达降低明显;6.pHY106-CHBV转染Huh7细胞48h后,筛选出差异表达基因共122条,其中34条基因表达明显增强,88条基因表达降低明显;7.实时定量PCR验证上述芯片结果,证实pHY106-BHBV转染Huh7细胞48h后,IFNGR2、GPR125、DDEF2和PI3K mRNA表达水平均不同程度下调,相对表达率分别为0.8、0.5、0.3和0.4,与基因芯片结果基本一致;pHY106-CHBV转染Huh7细胞48h后,EEF2、INF592表达下调,相对表达率分别为0.8和0.6,与基因芯片结果符合。8.shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBV HBsAg和HBeAg表达具有很强抑制作用,转染后48h显现明显的抑制作用,于72h抑制作用达高峰,对HBsAg和HBeAg表达抑制水平分别可达到80%和50%左右;9.shRNA共转染72h,shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBV HBsAgmRNA具有明显的抑制作用,抑制水平在60%～70%左右;10.Southern blot结果发现shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBV的复制具有明显的抑制作用。结论:1.本研究构建成的HBV真核重组表达载体pHY106-BHBV和pHY106-CHBV能够在Huh7细胞内复制和表达HBsAg和HBeAg,适合用于B和C基因型HBV的致病机制、病毒与机体的相互作用、新药开发等方面的研究工作。2.B和C基因型乙型肝炎病毒均能对Huh7细胞表达谱产生明显的改变,B和C基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞表达谱的改变明显不同,仅发现DDEF2在两者均下调,这表明B和C基因型乙型肝炎病毒对机体的影响可能存在不同的方式。3.shRNA·458和shRNA·635是良好的抑制B和C基因型HBV的有效工具;一定范围的错配仍然能够发挥shRNA的抑制HBV的作用。
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