核盘菌生物除草剂特性及其相关基因的克隆表达

论文摘要

随着人们对化学农药环境污染危害认识的提高,农田杂草治理逐渐向综合防治的方向发展。在杂草综合治理中生物除草剂和化学除草剂常常被一同使用。研究化学除草剂对生物除草剂的影响,解决两者的配合使用问题是进行杂草综合治理的前提。核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是正在被开发的生物除草剂。它与化学除草剂之间的相互作用效果有待于测定。本文对核盘菌（S. sclerotiorum）生长受五种化学除草剂影响的特征,该菌EPSP合酶的酶学特征及其相关基因arom的克隆和表达进行了研究,致力于提供可用于构建抗草甘膦生物除草剂的目的基因,为解决生物除草剂与化学除草剂之间的相容问题进行杂草综合治理奠定基础。在实验室条件下测定了不同浓度农达、莠去津、灭草松、百草枯和2.4-D丁酯对核盘菌（S. sclerotiorum）生长的影响。结果显示,这五种化学除草剂对核盘菌（S. sclerotiorum）菌核萌发无促进或抑制作用。该菌菌丝生长速度不受推荐使用浓度的莠去津、农达和2.4-D丁酯显著抑制（P>0.05）,而被推荐使用浓度的百草枯和灭草松极显著抑制（P<0.01）。实验中测试的各种浓度的农达不影响核盘菌（S. sclerotiorum）菌核生长,而莠去津、灭草松、百草枯和2.4-D丁酯不同程度地抑制了菌核生长。用离子交换层析和凝胶过滤层析部分纯化核盘菌（S. sclerotiorum）AROM蛋白,测定了各种因素对该菌EPSP合酶活性的影响。结果表明,该酶的最适反应pH值为7.2,最适反应温度为30℃,酸碱稳定性在pH6.7-7.2,温度稳定性在30-40℃,受K+和EDTA激活,受Fe 2+、Mn 2+、Cu2+等离子、脲和高浓度底物抑制,遵循顺序反应机制,相对于底物PEP受草甘膦竞争性抑制,与核盘菌（S. sclerotiorum）的草甘膦抗性相关。使用PCR方法扩增了核盘菌（S. sclerotiorum）arom基因组DNA序列。序列分析结果说明,该基因和粗糙脉胞霉（Neurospora crassa）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）arom基因同源。推测的蛋白序列与已知AROM蛋白同源,含有AROM蛋白特有的保守结构域、模式和保守氨基酸,与构巢曲霉（A. nidulans）、烟曲霉（A. fumigantus）AROM蛋白的亲缘关系较近。蛋白结构建模结果显示了该菌AROM蛋白各结构域的三级结构。采用载体pGEX-4t-2、pET28b与不同的大肠杆菌（Escherichia coli）菌株构建了分别含有重组质粒pGEX-DE、pGEX-E、pET-DE和pET-E的表达

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题的学术背景及其理论与实际意义
• 1.2 国内外文献综述
• 1.2.1 化学除草剂产业面临的问题和发展趋势
• 1.2.2 生物除草剂的发展现状
• 1.2.3 AROM蛋白和EPSP合酶的研究进展
• 1.2.4 基因扩增和表达的发展概况
• 1.3 核盘菌生物除草剂和EPSP合酶研究中有待解决的问题
• 1.4 课题的主要研究内容
• 第2章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 化学除草剂对核盘菌生长影响的测定
• 2.2.2 核盘菌EPSP合酶的酶学特征研究
• 2.2.3 核盘菌arom基因的克隆与序列分析
• 2.2.4 核盘菌EPSP合酶基因在大肠杆菌中的表达
• 2.2.5 核盘菌arom基因在酿酒酵母中的表达
• 第3章 化学除草剂对核盘菌生长影响的测定
• 3.1 化学除草剂对核盘菌菌丝生长的影响
• 3.2 化学除草剂对核盘菌菌核生长的影响
• 3.3 化学除草剂对核盘菌菌核萌发的影响
• 3.4 关于核盘菌生长受化学除草剂影响特征的分析
• 3.5 本章小结
• 第4章 核盘菌EPSP合酶的酶学特性研究
• 4.1 标准曲线的绘制
• 4.2 碳源和氮源对核盘菌EPSP合酶酶活的影响
• 4.3 核盘菌AROM蛋白的纯化
• 4.4 核盘菌EPSP合酶最适温度和最适pH值的测定
• 4.5 金属离子和化合物对核盘菌EPSPS酶活的影响
• 4.6 核盘菌EPSP合酶的热稳定性和酸碱稳定性
• 4.7 底物对核盘菌EPSP合酶的影响
• 4.8 核盘菌EPSP合酶Hill系数和表观动力学常数的测定
• 4.9 核盘菌EPSP合酶表观抑制剂常数Ki（PEP）的测定
• 4.10 关于核盘菌EPSPS酶学特征的分析
• 4.11 本章小结
• 第5章 核盘菌arom基因的克隆与序列分析
• 5.1 核盘菌arom基因片段的克隆和测序
• 5.2 核盘菌arom基因3′末端的扩增和测序
• 5.3 核盘菌arom基因5′末端的扩增和测序
• 5.4 核盘菌arom基因和AROM蛋白的序列分析
• 5.4.1 核盘菌arom基因的一级结构分析
• 5.4.2 核盘菌AROM蛋白的二级结构预测
• 5.4.3 核盘菌AROM蛋白结构域的三级结构预测
• 5.5 关于arom基因扩增方法的分析
• 5.6 关于核盘菌arom基因和AROM蛋白结构的分析
• 5.7 本章小结
• 第6章 核盘菌EPSP合酶基因在大肠杆菌中的表达
• 6.1 表达载体pGEX-DE和pGEX-E的构建、转化和表达
• 6.1.1 构建表达载体pGEX-DE和pGEX-E
• 6.1.2 pGEX-DE和pGEX-E转化子的分析
• 6.2 表达载体pET-DE和pET-E的构建、转化和表达
• 6.2.1 构建表达载体pET28-DE和pET28-E
• 6.2.2 pET28-DE和pET28-E转化子的分析
• 6.3 关于核盘菌EPSP合酶基因大肠杆菌表达的讨论
• 6.4 本章小结
• 第7章 核盘菌arom基因在酿酒酵母中的表达
• 7.1 核盘菌arom基因编码框序列的扩增和酶切鉴定
• 7.2 酵母表达载体pYE52-arom的构建
• 7.3 pYE52-arom酿酒酵母转化子的鉴定
• 7.4 pYE52-arom转化子的分子检测和EPSPS活性测定
• 7.5 关于核盘菌arom基因在酿酒酵母中表达的讨论
• 7.6 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 哈尔滨工业大学博士学位论文原创性声明
• 哈尔滨工业大学博士学位论文使用授权书
• 哈尔滨工业大学博士学位涉密论文管理
• 致谢
• 个人简历