普通小麦春化基因的克隆及表达特性分析

论文摘要

小麦的春化特性是决定小麦种植区划、引种用种及栽培技术的重要因素之一,小麦品种冬春性的强弱直接影响到小麦的穗分化进程及其对低温冻害的耐受能力,开展小麦春化分子调控机理的研究具有重要的理论和实践意义。本研究以具有不同春化特性的9个代表性小麦品种为试验材料,系统分析了它们的发育特性、春化基因组成及表达特性,主要研究结果如下:1、小麦春化基因VRN1的组成与春化发育特性在供试的9个品种中,低温春化处理在不同程度上均可缩短小麦的幼穗分化进程和苗穗期,且小麦品种的春性越强,其对低温的敏感性越低,冬性越强则对低温春化的敏感性越高。在不同低温春化处理条件下,辽春10号（Vrn-A1,Vrn-B1,Vrn-D1）和新春2号（Vrn-A1,vrn-B1,vrn-D1）苗穗期的变异系数在5%以下,为春性品种,辽春10号的春性最强;豫麦18（vrn-A1,vrn-B1,Vrn-D1）和郑麦9023（vrn-A1,Vrn-B1,vrn-D1）苗穗期的变异系数在5%～10%以下,为弱春性品种;周麦18（vrn-A1,vrn-B1,vrn-D1）和豫麦49-198（vrn-A1,vrn-B1,vrn-D1）苗穗期的变异系数在20%～24%之间,为半冬性品种;京841（vrn-A1,vrn-B1,vrn-D1）新冬18（vrn-A1,Vrn-B1,vrn-D1）和肥麦（vrn-A1,vrn-B1,vrn-D1）苗穗期的变异系数在25%～32%之间,为冬性品种,肥麦的冬性最强。通过基因组特异性PCR鉴定及序列分析,小麦品种的春化发育特性与春化基因Vrn1的显隐性组成密切相关,当Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1均为显性时,品种的春化发育特性为强春性,低温春化效应极低;当Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1为隐性时,品种的春化发育特性为半冬性到强冬性,低温春化效应从弱到强;当Vrn-A1或Vrn-B1或Vrn-D1为显性时,品种的春化发育特性为春性,Vrn1显性基因的春性效应表现为Vrn-A1＞Vrn-B1>Vrn-D1的趋势,与品种的春性强弱趋势表现一致。2、小麦春化基因VRN1的克隆和表达特性通过PCR特异扩增技术克隆了春化基因VRN1的cDNA片段,序列分析显示该基因的A、B和D等位基因间有差异,B和D基因组差异较小,A基因组与B和D基因组差异较大;VRN1基因在不同品种间差异较小,其序列有较高的保守性。通过特异性半定量RT-PCR技术对VRN1的三个等位基因的表达特性分析显示,强春性品种（辽春10号）的3个等位基因在1叶期（圆锥期）就有较低水平的表达,从3叶期（二棱期）开始保持高水平表达至开花期;春性品种新春2号、弱春性品种豫麦18和郑麦9023中,均有一个显性等位基因（分别为Vrn-A1、Vrn-D1和VRN-B1）在1叶期（圆锥期）就启动表达,而另外两个等位基因的表达则较滞后,这与其基因组成（分别为Vrn-A1vrn-B1vrn-D1、vrn-A1vrn-B1Vrn-D1和vrn-A1Vrn-B1vrn-D1）相一致;在半冬性（周麦18和豫麦49-198）和冬性品种（京841和肥麦）中,三个等位基因均对低温春化高度敏感,低温春化的诱导效应具有vrn-A1＞vrn-B1＞vrn-D1的趋势。结果表明,VRN1基因的表达启动与等位基因的显隐性组成密切相关,显性等位基因的表达启动较早,而隐性等位基因则较滞后;低温春化能够诱导VRN1的表达;在通过春化阶段后VRN1维持高水平的表达,并一直持续至开花期。3、小麦春化基因VRN2的克隆和表达特性通过PCR特异扩增技术克隆了春化基因VRN2的两个成员ZCCT1和ZCCT2,序列分析显示该基因可编码包含CCT结构域的功能蛋白,基因组结构分析发现该基因包含1个1249bp～1449 bp的内含子。表达特性分析显示,在强春性品种辽春10号中未检测到其表达;在春性品种新春2号、弱春性品种豫麦18和郑麦9023中,只有1叶期（圆锥期）有表达;在其它检测的半冬性和冬性品种中,VRN2基因的表达与VRN1的表达互为消长,即在通过春化阶段以前表达,而在通过春阶段后则停止表达,停止表达时间与幼穗发育通过二棱期一致;VRN2基因的表达受低温春化的抑制,因此在普通小麦中,不需要春化（强春性品种）或当春化发育阶段（春性、冬性品种）通过时,该基因即不表达或表达量极低。4、小麦春化基因VRN3的序列特征和表达特性对VRN3基因的克隆和序列分析显示,该基因在普通小麦中至少存在3个成员;其cDNA序列分析显示该基因编码的蛋白属于磷脂结合蛋白（phospholipid-binding proteins）家族成员,基因组结构分析显示,该基因包含2个内含子,且内含子序列在品种间存在较大差异。通过特异性半定量RT-PCR技术对VRN3的表达特性分析显示,VRN3的表达特性有三种类型:即在圆锥期表达起始（辽春10号和豫麦18）;在伸长期或单棱期开始表达（新春2号、郑麦9023、京841和新冬18）;在二棱期之后起始表达（周麦18和豫麦49-198和肥麦）。结果表明,所有品种VRN3的表达持续至开花期;低温诱导能够诱导或增强小麦VRN3的表达5、小麦春化基因的时空表达特性VRN1在小麦根、茎秆、叶片、花药、胚珠、发育过程的种子中均有不同水平的表达,而在于种子和种子萌发过程中不表达,不过在冬性品种中该基因的表达特性受春化进程的影响。VRN2的表达与小麦的春化进程密切相关,仅在小麦通过二棱期前的叶片中表达,而在其它发育时期的叶片及其它组织中均未检测到其表达;VRN3的表达除了在根系中未检测到外,其时空表达特性与VRN1相似。从三个春化相关基因的表达特性来看,VRN1基因随小麦发育进程及低温诱导而表达,冬性越强,促进表达所需要低温诱导的时间越长;VRN3的表达滞后于VRN1的表达,并与VRN1有相同的表达趋势;VRN2基因在强春性品种中不表达,其它品种仅在幼穗分化通过二棱期前有较高水平的表达,二棱期后不管是冬性品种还是春性品种,该基因均不表达,而VRN1和VRN3均有较高水平的表达;推断VRN1和VRN3基因是生殖生长阶段或开花过程必须的基因,其表达产物在生殖生长中起重要作用。本研究的创新性主要体现在:（1）首次明确了我国不同小麦生态区代表品种的VRN1基因的显隐性组成,及不同品种中3个春化基因VRN1、VRN2、VRN3的表达特性与小麦春化发育特性的对应关系,发现三个显性Vrn1等位基因具有春性累加效应,而且春性特性表现为Vrn-A1＞Vrn-B1＞Vrn-D1,是控制小麦春性强弱的分子基础。（2）明确了不同品种间3个春化基因VRN1、VRN2和VRN3基因序列的差异特征,发现VRN1基因编码区具有较高的保守性,在不同基因组和品种间VRN1序列差异主要在内含子区,内含子区差异是进一步开发春化发育的分子标记和品种特性鉴定的关键。（3）进一步明确了普通小麦中3个春化基因互作机理,显性Vrn1控制春性发育特性,隐性vrn1控制冬性发育特性,VRN1和VRN3基因是生殖生长阶段或开花过程必需的基因,其表达产物在生殖生长中起重要作用;显性Vrn-A1不受VRN2的抑制表达较早,隐性vrn1的表达受VRN2的抑制,VRN2对VRN1和VRN3具有负向调节作用,VRN3正向调节VRN1。VRN1和VRN3基因都受低温诱导而表达,VRN2受低温诱导而被抑制,从而使小麦表现出低温春化的效应。

论文目录

• 中文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 植物开花的分子调控途径研究进展
• 1.1 春化作用途径
• 1.2 光周期途径
• 1.3 自主开花途径
• 1.4 赤霉素途径
• 1.5 整合途径
• 2 小麦发育的分子调控机理研究进展
• 2.1 春化基因
• 2.1.1 VRN1基因的克隆和表达
• 2.1.2 VRN2基因的克隆和表达
• 2.1.3 VRN3的克隆和表达
• 2.2 光周期基因
• 2.3 早熟性基因
• 2.4 小麦发育调控基因的作用模式研究
• 3 春化作用与小麦生长发育和产量形成的关系
• 3.1 与光周期的关系
• 3.2 与生育期的关系
• 3.3 与产量形成的关系
• 3.4 与抗寒性的关系
• 4 本研究的目的和意义
• 参考文献
• 第二章 春化处理对不同小麦品种发育进程的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 低温春化对不同小麦品种苗穗期的影响
• 2.2 低温春化对不同小麦品种幼穗分化的影响
• 2.3 低温春化条件下叶龄与幼穗分化进程的关系
• 3 结论与讨论
• 参考文献
• 第三章 小麦春化基因VRN1的组成特性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 DNA的提取
• 1.3 PCR分子标记引物设计
• 2 结果与分析
• 2.1 VRN-A1基因启动子和第一内含子片段的分析
• 2.2 VRN-B1基因第一内含子片段的缺失分析
• 2.3 VRN-D1基因第一内含子片段的缺失分析
• 3 结论与讨论
• 参考文献
• 第四章 小麦春化基因VRN1的cDNA克隆和表达特性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 材料处理
• 1.3 DNA和RNA的提取
• 1.4 VRN1的克隆
• 1.5 VRN1基因的表达特性研究
• 2 结果分析
• 2.1 VRN1基因的cDNA克隆
• 2.2 VRN1基因片段的克隆
• 2.3 VRN1基因的表达特性研究
• 2.3.1 春性小麦VRN1基因的表达特性研究
• 2.3.2 冬性小麦VRN1基因的表达特性
• 3 结论与讨论
• 3.1 VRN1基因具有较高的保守性
• 3.2 VRN1的表达特性与基因型的关系
• 3.3 VRN1基因的表达特性与小麦发育进程的关系
• 参考文献
• 第五章 小麦春化基因VRN2的克隆及表达特性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 材料处理
• 1.3 VRN2基因的克隆
• 1.3.1 DNA的提取及VRN2的基因组克隆
• 1.3.2 RNA的提取及VRN2基因的cDNA克隆
• 1.4 VRN2基因的表达特性研究
• 2 结果与分析
• 2.1 VRN2基因的cDNA克隆
• 2.2 VRN2基因的基因组克隆
• 2.3 VRN2基因的表达特性分析
• 2.3.1 春性小麦VRN2基因的表达
• 2.3.2 冬性小麦VRN2基因的表达
• 3 结论与讨论
• 3.1 VRN2基因的序列特征
• 3.2 VRN2基因的表达特性分析
• 参考文献
• 第六章 小麦春化基因VRN3的克隆与表达特性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料处理
• 1.2 VRN3基因的克隆
• 1.3 VRN3基因的表达特性研究
• 2 结果与分析
• 2.1 VRN3的cDNA克隆
• 2.2 VRN3的基因组克隆
• 2.3 VRN3的表达特性
• 2.3.1 春性小麦VRN3的表达特性
• 2.3.2 冬性小麦VRN3的表达特性
• 3 结论与讨论
• 3.1 小麦VRN3基因的序列特征
• 3.2 小麦春化基因VRN3表达特性分析
• 3.3 VRN3的表达特性与低温春化的关系
• 3.4 普通小麦中三个春化基因的互作关系
• 参考文献
• 第七章 黄淮麦区小麦品种中春化基因VRN1的组成分析及时空表达特性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料及处理
• 1.2 DNA的提取
• 1.3 RNA提取
• 1.4 引物设计
• 1.5 春化基因VRN1、VRN2和VRN3的表达特性
• 2 结果与分析
• 2.1 VRN1基因组成分析
• 2.1.1 VRN-A1基因的显隐性分析
• 2.1.2 VRN-B1基因的显隐性分析
• 2.1.3 VRN-D1基因的显隐性分析
• 2.2 春化基因在小麦不同组织中的表达特性
• 2.3 春化基因在种子发育过程中的表达特性
• 2.4 春化基因在种子萌发过程中的表达特性
• 3 结论与讨论
• 3.1 黄淮麦区小麦VRN1的基因组成与发育特性的关系
• 3.2 春化基因表达的组织特异性分析
• 参考文献
• 主要研究结论及创新点
• 英文摘要
• 致谢
• 博士研究生在读期间发表和投稿的论文