利用RNA干涉技术研究Smad2和Smad3在鼠成纤维细胞TGF-β信号通路中的不同作用

论文摘要

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是由双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）介导的一种特异性基因表达沉默,是一种古老但在进化上又高度保守的基因表达调节机制。关于RNAi的基础研究和应用研究迅速成为21世纪初生命科学的热点之一,在人、小鼠及其他哺乳动物中,RNAi已广泛应用于基因功能验证、信号转导和基因治疗等领域的研究。由于哺乳动物缺乏体内siRNA介导的沉默放大效应,利用DNA载体在细胞内稳定转录出siRNAs,并维持长时间抑制效果的方法已被证明是行之有效的。转化生长因子β（TGF-β,transforming growth factors beta）,在细胞生长、发育、分化和物质代谢等方面均有极其重要的作用,而Smads蛋白是目前所知的唯一的TGF-β受体胞内激酶底物,在TGF-β信号转导中起着关键的作用。本研究通过构建RNAi的DNA表达载体,特异地、有效地抑制TGF-β/Smads信号通路中通路特异性Smads—Smad2和Smad3基因在NIH/3T3小鼠成纤维细胞中的表达,分别在mRNA水平和蛋白质水平研究Smad2和Smad3的不同作用和相互关系及在TGF-β信号转导过程中所处的地位。具体研究结果如下:1.确定了外源TGF-β1诱导NIH/3T3细胞中Smads蛋白表达的最佳浓度和时间。通过设置添加TGF-β1处理的不同浓度梯度和时间梯度,利用半定量RT-PCR和Western-blottting分析方法确定诱导Smads蛋白达到最高表达量的浓度和时间分别为5μg/L和3小时,并发现Smad3的表达对TGF-β1的刺激尤为敏感,从0.5小时起一直持续高效表达。2.构建了靶基因的shRNA DNA表达载体。按照siRNA的设计规则,针对Smad2和Smad3基因分别设计了5条21bp的siRNA序列,合成了10条62-64bp的双链DNA寡核苷酸序列,并将它们分别插入到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen质粒载体中,获得了包括阳性和阴性对照的12个shRNA的DNA表达质粒,并经酶切和测序验证。3.建立了一套比较有效的RNAi的技术体系。将所获得12个RNAi表达质粒利用脂质体介导的方法分别转染NIH/3T3小鼠成纤维细胞,提取转染细胞的总RNA和总蛋白质,采用半定量RT-PCR和Western-blotting方法分析了siRNA抑制效果,获得了两个特异地、有效地抑制Smad2和Smad3表达的RNAi表达质粒。分析这两个有效的siRNA序列发现,正义链第10位的碱基在设计中具有重要的作用,当第10位为U时,抑制效率最高,其次是C,最后是A/G。4.分析了Smad2和Smad3在TGF-β信号转导过程中的不同作用。在mRNA水平和蛋白质水平分别检测了Smad2-depleption细胞、Smad3-depleption细胞和Smad2+3-deoleption细胞中Smad2、Smad3和Smad4的表达,发现在Smad2-depleption细胞中Smad3和Smad4的表达提高,而在Smad3-depleption细胞中Smad2的表达没有发生改变,Smad4的表达降低。表明TGF-β信号在NIH/3T3细胞转导过程中,Smad3起到关键的调节作用。5.建立了混合RNAi表达质粒有效地抑制靶基因表达的方法。分别针对于Smad2和Smad3 mRNA序列不同区段的4个shRNA表达质粒等比例混合,构成Smad2-RNAi池和Smad3-RNAi池,利用脂质体将RNAi混合质粒共同导入NIH/3T3细胞中,经半定量RT-PCR和Western-blotting方法分析,发现RNAi池抑制Smad2或Smad3表达的效果要明显高于单一的RNAi表达质粒。表明针对靶基因mRNA序列不同区段的混合RNAi表达质粒可以提高RNAi的抑制效果,为有效利用RNAi表达载体研究基因的功能提供了一个新的策略。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 基因功能的研究
• 1.1 生物信息学预测基因功能
• 1.1.1 同源性反应了进化关系
• 1.1.2 同源性分析可以给出整个基因或某一区段功能的信息
• 1.2 研究基因功能的方法
• 2 RNA干涉现象（RNAI,RNA INTERFERENCE）
• 2.1 基因沉默
• 2.2 RNAi技术的发现
• 2.3 RNA干涉的机制和特点
• 2.3.1 RNA干涉技术中相关酶类或蛋白质以及基因
• 2.3.2 RNAi的作用机制
• 2.3.3 RNAi的特点
• 2.4 RNAi在哺乳动物中的研究
• 2.5 siRNA的获得
• 2.5.1 siRNA序列的设计
• 2.5.2 siRNA的合成
• 2.6 RNA干扰技术的应用及展望
• 2.6.1 高通量研究基因的功能
• 2.6.2 基因治疗
• 2.6.3 信号通路
• 2.6.4 局限性
• 3 TGF-B超家族与SMAD蛋白
• 3.1 TGF—β生物学效应
• 3.2 TGF—β信号传导通路
• 3.2.1 TGF—β受体
• 3.2.2 Smads蛋白
• 3.3 Smad介导TGF-β信号转导
• 3.4 Smads在脊椎动物中的功能
• 3.5 TGF-β/Smad2,3信号通路的研究进展
• 第二章 研究目的及意义
• 第三章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 实验所用细胞、菌株、质粒载体
• 1.2 主要试剂和试剂盒
• 1.3 常用缓冲液和试剂配置
• 1.4 质粒提取缓冲液
• 1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液
• 1.6 Western blot缓冲液
• 1.7 抗生素类
• 1.8 培养基
• 1.8.1 细菌培养基
• 1.8.2 细胞培养基
• 1.9 主要仪器和设备
• 2 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 DNA片段的回收
• 2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 2.4 连接产物转化
• 2.5 质粒DNA的提取
• 2.5.1 碱裂解法小量制备质粒
• 2.5.2 超纯质粒的提取
• 2.6 阳性克隆子的鉴定
• 2.6.1 酶切鉴定
• 2.6.2 序列测定
• 2.7 半定量RT-PCR反应
• 2.7.1 引物设计
• 2.7.2 细胞总RNA的提取
• 2.7.3 cDNA第一链合成
• 2.7.4 PCR反应
• 2.7.5 RT-PCR反应产物的检测
• 2.8 SDS-PAGE和Western-blot
• 2.8.1 SDS-PAGE电泳
• 2.8.2 Western-blot分析
• 2.9 RNA interference方法的建立
• 2.9.1 siRNA的设计与合成
• 2.9.2 shRNA表达质粒的构建
• 2.9.3 脂质体介导的细胞转染
• 2.9.4 RNA干扰效果的分析
• 第四章 结果与分析
• 1 TGF-B1诱导SMADS蛋白的表达
• 1.1 TGF-β1浓度的确定
• 1.1.1 TGF-β1浓度梯度的设置
• 1.1.2半定量RT-PCR结果
• 1.2 TGF-β诱导时间的确定
• 1.2.1 TGF-β1诱导时间分组
• 1.2.2 半定量RT-PCR结果
• 1.3 Western-blotting验证
• 2 SHRNA表达质粒的构建
• 2.1 siRNA序列的设计
• 2.2 shRNA表达质粒的构建
• 2.3 线性RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen环化成载体质粒
• 3 SHRNA效果分析
• 3.1 shRNA表达质粒的转染
• 3.2 Smad2和Smad3的干扰效果
• 3.2.1 RT-PCR分析Smad2和Smad3的mRNA表达水平
• 3.2.2 Western-blotting分析Smad2/3的表达水平
• 3.2.3 RNAi有效时间的确定
• 3.2.4 在Smad2-depletion细胞和Smad3-depletion细胞中Smads蛋白之间的相互关系
• 4 SHRNA混合质粒干扰效果分析
• 4.1 Smad2-shRNA混合质粒干扰效果的RT-PCR分析
• 4.2 Smad2-shRNA混合质粒干扰效果的Western-blotting分析
• 4.3 Smad3-shRNA混合质粒干扰效果分析
• 第五章 讨论
• 1 关于基因的功能研究
• 2 关于小鼠成纤维细胞
• 3 关于RNAI技术体系
• 3.1 siRNA序列的设计
• 3.2 关于shRNA
• 3.3 shRNAs导入方式
• 3.4 siRNA效应的持续时间
• 3.5 RNAi效应的分析方法
• 3.6 混合RNAi质粒
• 4 关于TGF-B信号通路
• 4.1 TGF-β1诱导时间和浓度
• 4.2 TGF-β1诱导Smads蛋白的表达
• 4.3 Smad2和Smad3的不同作用
• 4.4 关于Smad4
• 5 下步工作计划
• 小结
• 参考文献
• 博士在读期间发表论文
• 致谢