单核增生李斯特菌对于宿主抗病毒能力的影响

论文摘要

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,54002)是一种胞内病原菌,可以通过食源性方式感染人类,尤其对免疫力低下的群体的健康造成很大的威胁。单增李斯特菌所为一种病原体在微生物学和细胞生物学方面已经有深入的研究。最近以单增李斯特菌为胞内病原菌的免疫学研究亦有较大进展。单增李斯特菌可以通过释放毒力因子溶解素LLO介导参与SUMO化修饰的唯一的E2结合酶Ubc9的降解从而下调宿主细胞整体水平的SUMO化水平,影响细胞的多种生命活动。作为胞内病原菌的代表,人们对单增李斯特菌的分子生物学、细胞生物学以及免疫学方面有了很大的了解。共感染,由于其更接近于人体真实的、复杂的感染事件,是当前感染免疫领域的一个新的重要的研究方向。我们实验室之前的结果表明,参与病毒识别和I型干扰素应答的MDA5分子可以被SUMO化修饰以增强其活性。我们猜测单增李斯特菌感染是否可以通过下调MDA5的SUMO化水平从而干扰宿主的抗病毒应答。正如期望的那样,MDA5分子的SUMO化水平是下调的,但是,出人意料的是,我们发现单增李斯特菌感染可以直接下调MDA5分子的水平。进一步的研究发现,李斯特菌的主要的毒力因子LLO直接介导了这种效应。我们还发现MDA5分子的下调是发生在翻译后水平上的,而不是在转录水平和翻译水平。使用MG132阻断蛋白酶体系统可以阻止MDA5分子的降解过程,这说明LLO介导的MDA5的降解过程是蛋白酶体依赖的。同时我们还发现增强的SUMO化修饰可以提高MDA5的稳定性。由此,我们提出单增李斯特菌的毒力因子LLO可以通过降低MDA5分子的SUMO化修饰水平,从而使泛素可以竞争性的结合到MDA5分子,以一种蛋白酶体依赖的途径发生降解。单增李斯特菌感染导致的MDA5的下调确实影响了宿主细胞的抗病毒I型干扰素应答,增强了病毒在胞内的的复制和感染能力。我们第一次发现单增李斯特菌感染可以直接降解宿主胞内的病毒识别分子MDA5,这使得我们对胞内菌与宿主之间的相互作用有了更深的认识和了解。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 单核细胞增生性李斯特菌
• 1.1.1 李斯特菌与单核细胞增生性李斯特菌
• 1.1.2 单核细胞增生性李斯特菌的生活周期
• 1.1.3 单核细胞增生性李斯特菌的主要毒力因子
• 1.1.4 李斯特菌感染的免疫学研究进展
• 1.2 天然免疫识别与I 型干扰素应答
• 1.2.1 天然免疫识别
• 1.2.2 I 型干扰素
• 1.3 SUMO 化修饰研究进展
• 1.3.1 蛋白质翻译后修饰
• 1.3.2 SUMO 化修饰概述
• 1.3.3 SUMO 化修饰的反应过程
• 1.3.4 参与SUMO 化修饰过程的酶
• 1.3.5 SUMO 化修饰的功能
• 1.3.6 SUMO 化修饰与泛素化修饰
• 1.3.7 SUMO 化修饰与疾病
• 第二章 材料和方法
• 2.1 细胞培养和细胞转染
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 细胞培养
• 2.1.3 细胞冻存
• 2.1.4 细胞复苏
• 2.1.5 细胞的转染
• 2.2 质粒和菌株
• 2.2.1 用于转染的大量Endofree 质粒的提取
• 2.2.2 李斯特菌LLO 表达载体的构建和蛋白纯化
• 2.3 病毒的扩增和滴度测定
• 2.3.1 EMCV 的扩增
• 2.3.2 EMCV 的纯化
• 2.4 单增李斯特菌的培养
• 2.4.1 李斯特菌培养
• 2.4.2 BHI 的配制
• 2.4.3 BHI 固体培养基的配制
• 2.5 RT-PCR 及Real Time PCR 检测基因的表达
• 2.5.1 Trizol 细胞总RNA 的提取
• 2.5.2 反转录
• 2.5.3 病毒RNA 的提取
• 2.5.3.1 提取培养上清的病毒RNA
• 2.5.3.2 用 TRIzol 试剂提取附着于细胞的 EMCV 病毒 RNA
• 2.5.4 Real time PCR
• 2.6 免疫共沉淀和免疫印记实验
• 2.7 荧光素酶报告基因活性检测方法
• 2.8 统计学处理
• 第三章 实验结果
• 3.1 单增李斯特菌能显著下调MDA-5 水平
• 3.1.1 单增李斯特菌能下调过表达情况下的MDA-5 水平
• 3.1.2 单增李斯特菌也能下调Hela 细胞中的内源MDA-5 水平
• 3.2 单增李斯特菌的毒力因子LLO 能够导致MDA-5 水平下调
• 3.2.1 LLO 缺陷的单增李斯特菌不能下调MDA-5 水平
• 3.2.2 体外纯化的LLO 蛋白也能下调MDA-5 水平
• 3.3 单核增生李斯特菌感染下调MDA5 蛋白水平不是发生在转录水平
• 3.4 单核增生李斯特菌感染可能在翻译后水平上下调MDA5 蛋白水平
• 3.5 单核增生李斯特菌感染下调MDA5 蛋白水平依赖于泛素-蛋白酶体途径
• 3.6 单核增生李斯特菌感染下调MDA5 蛋白水平可能与SUMO 化修饰相关
• 3.7 单核增生李斯特菌感染可以下调MDA5 介导的I 型干扰素应答
• 3.8 单核增生李斯特菌感染可以增强MDA5 特异性病毒的复制
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果