内皮祖细胞在严重创作性脑损伤患者外周血中表达及预后的意义

论文摘要

背景：EPCs（endothelial progenitor cells）来源于胚胎的中胚层和出生后的骨髓,不仅参与胚胎血管生成,而且近年研究发现,EPC也参与出生后的血管新生过程,是一群被发现存在于胎肝、脐带血和成人外周循环血中的、能够分化为内皮细胞的多潜能细胞,这群细胞不但具有修复损伤内皮细胞的功能而且.还能增强组织缺血后的血管发生（vasculogenesis）和血管新生（angiogenesis）,提示在缺血性疾病、防止血管再狭窄、血管创伤愈合等过程中具有重要的治疗作用。最近的研究显示：EPCs可促进颅脑创伤大鼠损伤区脑组织的血管、神经新生以及神经功能恢复,这为下一步的临床应用奠定了基础。目的1.研究创伤性脑损伤患者外周血来源内皮祖细胞的分离、培养、增殖及鉴定。2.探讨循环内皮祖细胞对创伤性脑损伤患者血管损伤修复的可能机制3.探讨颅脑损伤对循环内皮祖细胞的动员及预后判断的意义。方法1.应用密度梯度离心法分离创伤性脑损伤患者外周血单个核细胞,应用EGM培养基,置于37℃、5%C02培养箱中培养。培养3天换液去除未贴壁细胞,以后每3天换液一次,倒置相差荧光显微镜下动态观察培养细胞的形态变化特征。通过硫氰酸荧光素标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-ac-LDL）摄取试验和荆豆凝集素（FITC-UEA-1）结合实验,进行内皮祖细胞的功能鉴定。体外培养至第7天,采用流式细胞仪检测CD34, CD133双荧光标记阳性细胞所占比率。2.连续收集2009年1月至2010年4月天津医科大学总医院神经外科治疗的重型创伤性脑损伤（TBI）而无肢体损伤患者外周血及血清标本。创伤性颅脑损伤患者损伤程度由Glasgow Coma Scale （GCS）评分决定。同期收集18-60岁健康志愿者外周血及血清标本。严重创伤性脑损伤患者及对照组外周血内皮祖细胞数量分别在脑损伤后的1天、4天、7天、14天及21天用流式细胞仪进行检测。在相同时间点对上述两组血清的血管生成素（Ang-1）及血管内皮生长因子（VEGF）进行ELISA检测。3.收集严重创伤性脑损伤患者21例及20例正常对照组的外周血及血清标本。分别于创伤性脑损伤后的1天、4天、7天、14天及21天用流式细胞仪检测外周血内皮祖细胞的数量及用ELISA检测血清基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及血管内皮生长因子（VEGF）变化。并对创伤性脑损伤患者伤后6个月的glasgow outcome scale（GOS）评分进行前瞻性的分析。结果1.培养3天换液去除未贴壁细胞后,可见少数细胞呈集落式生长,细胞形态多为短梭型或多角形。培养7天,梭型细胞较前增多,形成细胞团。14天可见到细胞形成索状或网状血管结构。倒置相差荧光显微镜下观察显示胞质和胞膜呈绿色和红色双荧光,说明内皮祖细胞能特异性吸附Dil-acLDL和结合FITC-UEA-1,具有内皮细胞功能。流式细胞仪鉴定EPC细胞表型CD34和CD133双阳性的细胞为18.57%。2.与对照组相比,循环内皮祖细胞在严重创伤性脑损伤后第4天降低,第7天达到最高。血管内皮生长因子水平始终高于对照组水平。血管生成素1在第14天到达最高峰。循环内皮祖细胞与严重脑创伤后7天、14天的Ang-1和VEGF血清水平明显相关。3.与对照组相比,循环内皮祖细胞的变化与前期研究一致。颅脑创伤后第7天达到高峰,并且与患者伤后6个月的GOS评分明显相关。MMP-9和VEGF水平伤后始终高于对照组。循坏内皮祖细胞与创伤性脑损伤后1天的GCS评分相关,与创伤性脑损伤后7天、14天的MMP-9和VEGF水平相关。结论1.创伤性脑损伤患者外周血来源的单个核细胞在体外应用EGM培养基培养,可以分化为内皮祖细胞,为内皮祖细胞研究奠定了基础。2.血管生成素-1（Angiopoietin-1）和血管内皮生长因子（VEGF）是调节血管生成反应和维持血管完整性的两个关键性蛋白,在患者脑创伤后14天达到峰值,并且在脑创伤后7天、14天分别与内皮祖细胞相关,这些结果提示严重创伤性脑损伤后血管内皮生长因子、血管生成素-1及循环内皮祖细胞有可能参与到了血管修复的病理生理过程中。3.我们的研究结果显示创伤性脑损伤后循环内皮祖细胞升高,MMP-9和VEGF可能参与调节严重创伤性脑损伤后内皮祖细胞由骨髓动员至外周血的过程当中。我们的研究结果还显示循环内皮祖细胞与患者的神经功能恢复相关联,这些证据提示循环内皮祖细胞是判断血管新生及预后的潜在生物指标。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、创伤性脑损伤患者外周血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
• 1.1 对象与方法
• 1.1.1 主要仪器和实验试剂
• 1.1.2 主要试剂、液体的配制
• 1.1.3 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 内皮祖细胞形态变化及生长状况
• 1.2.2 外周血来源EPCs的培养及生长曲线分析
• 1.2.3 流式细胞仪鉴定EPC细胞表型
• 1.2.4 摄取DiI-acLDL和结合FITC-UEA-1结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、循环内皮祖细胞对创伤性脑损伤患者脑血管损伤修复机制的探
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要试剂和仪器
• 2.1.2 一般资料
• 2.1.3 血样采集
• 2.1.4 外周血单个核细胞分离及血清样本准备
• 2.1.5 CD34/CD133双阳性细胞标记EPCs及流式细胞仪检测
• 2.1.6 流式细胞仪检测方法
• 2.1.7 Ang-1与VEGF的ELISA检测
• 2.1.8 统计学方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 年龄及性别比较
• 2.2.2 对照组与病例组EPCs的比较
• 2.2.3 创伤性脑损伤（TBI）患者及正常对照组（CTL）血清Ang-1水平比较
• 2.2.4 创伤性脑损伤（TBI）患者及正常对照组（CTL）血清VEGF水平比较
• 2.2.5 创伤性脑损伤（TBI）患者外周血内皮祖细胞数量与Ang-1及VEGF水平的相关性
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、颅脑创伤后内皮祖细胞动员及预后判断的意义
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要试剂和仪器
• 3.1.2 病人资料
• 3.1.3 血样采集
• 3.1.4 外周血单个核细胞分离及血清样本准备
• 3.1.5 CD34/CD133双阳性细胞标记EPCs及流式细胞仪检测
• 3.1.6 流式细胞仪检测方法
• 3.1.7 MMP-9与VEGF的ELISA检测
• 3.1.8 严重TBI患者预后判断
• 3.1.9 统计学方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 GCS评分结果
• 3.2.2 创伤性脑损伤患者及正常对照组性别、年龄的比较
• 3.2.3 创伤性脑损伤患者及正常对照组外周血内皮祖细胞数量比较
• 3.2.4 创伤性脑损伤患者及正常对照组血清MMP-9水平比较
• 3.2.5 创伤性脑损伤患者及正常对照组血清VEGF水平比较
• 3.2.6 创伤性脑损伤患者外周血内皮祖细胞数量与GCS评分及GOS评分的相关性
• 3.2.7 创伤性脑损伤患者外周血内皮祖细胞数量与MMP-9水平及VEGF水平的相关性
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 全文结论
• 论文创新点
• 参考文献
• 发表论文及参加科学研究情况
• 综述
• 综述一 内皮祖细胞研究现状
• 综述二 内皮祖细胞移植治疗
• 综述参考文献
• 致谢