紫贻贝多糖提取分离、结构鉴定及其生物活性的初步研究

论文摘要

贻贝是重要的世界性养殖品种,以紫贻贝产量占有最大,并以新鲜贻贝为主要销售形式,经济效益低。贻贝不但作为传统的滋补食品,且具有较高的营养价值和多种药理功效。文献报道,贻贝及其提取物具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、降血脂等功能活性。其中,多糖是紫贻贝中的主要活性成分之一,目前对其研究主要集中在紫贻贝粗多糖上,而对紫贻贝多糖组分的提取、分离纯化及结构功能研究报道较少。因此,开发利用紫贻贝多糖具有理论价值和实际意义。本课题以嵊泗枸杞所产紫贻贝为试验材料,研究了紫贻贝多糖的提取、脱蛋白、分离纯化、结构鉴定及其免疫抗肿瘤活性。主要研究结果如下：采用响应面方法优化紫贻贝多糖的热水提取工艺。实验以冷冻干燥后的紫贻贝粉末为原料,研究了浸取温度、浸取时间及液固比对紫贻贝多糖得率的影响,确定了提取的最佳工艺参数为：浸提温度93℃,浸提时间4.2h,液固比44.3：1,在此条件下多糖得率可达19.73%。对热水提取醇沉后所得紫贻贝粗多糖MES进行脱蛋白工艺的研究。本实验采用三种不同方法—Sevag法、酶法和酶法与Sevag联用法并比较了对MES的脱蛋白的效果。结果表明酶法与Sevag联用法为最合适的方法,其工艺条件为：酶法：酶种为碱性蛋白酶,最优酶解参数：酶量[E]/[S]1.79%,pH9.19,酶解温度61.79℃；Sevag法：氯仿：正丁醇=4：1（V/V）,料液比=3：1（V/V）,通过三次脱蛋白处理。对经酶法与Seveg联用法脱蛋白后的紫贻贝多糖MES-I进行分离纯化研究。本实验先将MES-I溶液过0.45μm微孔滤膜抽滤,其后采用10000的超滤膜进行超滤处理。再通过Marco-Prep DEAE离子交换层析和Sephrose 4B凝胶柱层析进一步分离纯化得到三个组分（MES-I-I1、MES-I-12和MES-I-2）。采用Sephrose 6B凝胶过滤层析法、高效液相色谱（HPLC）和醋酸薄膜电泳三种方法对三个组分进行纯度分析,确定MES-I-11、MES-I-12和MES-I-2为均一多糖组分。研究了MES-I-I1、MES-I-12和MES-I-2三个均一组分的理化性质和初级结构。通过苯酚-硫酸法测定,MES-I-I1、MES-I-12和MES-I-2的总糖含量分别为95.2%、91.2%和94.8%。颜色反应和紫外光谱（UV）法检测推断三个均一组分都不含有蛋白质和核酸。HPLC法测定了MES-I-I1、MES-I-12和MES-I-2的分子量分别为572.8KD、18.20KD和69.50KD。采用傅里叶红外光谱（FT-IR）法初步判断三个组分为糖类化合物,且其多糖结构均含有a-D-葡萄吡喃糖苷键。气质联用（GC-MS）法分析表明MES-I-11、MES-I-12和MES-I-2分别由不同摩尔比的3种单糖—甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成。其中,MES-I-11的组成成分甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为2.74：1：18.06;MES-I-12的摩尔比为2.2：1：19.44；MES-I-2的摩尔比为2.87：1：3.63。核磁共振法（NMR）分析结果是MES-I-I1、MES-I-12和MES-I-2均有α-D-葡萄糖吡喃糖苷,且在C6上有发生羟基被取代,主要以α-D-Glc（1→4）-为主要的连接方式。采用噻唑盐（MTT）比色法研究MES-I-1、MES-I-2、MES-I-11和MES-I-12的免疫活性。结果表明,在ConA诱导小鼠T淋巴细胞的体外增殖中,各组分均不同程度抑制细胞的增殖反应。在高浓度时有明显抑制作用,显著性分别为P<0.01、P<0.001、P<0.05、P<0.01。在LPS诱导小鼠B淋巴细胞的体外增殖反应中,MES-I-1和MES-I-12没有显著影响,MES-I-2在高浓度下呈促进作用（P<0.05）,MES-I-11在中浓度下也呈促进作用,在低浓度条件下则呈增殖抑制作用（P<0.05）。对K562肿瘤细胞的抗肿瘤活性研究实验表明,MES-I-1、MES-I-2、MES-I-11和MES-I-12在各浓度下均表现出不同程度的抗肿瘤活性,并呈一定的量效关系,其中MES-I-2在低浓度和高浓度时的抑瘤率分别为24.48±1.72%和62.82±8.57%,表现出较强的抗肿瘤作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 贻贝的研究进展
• 1.1.1 贻贝的概述
• 1.1.2 贻贝的营养价值和药用价值
• 1.1.3 贻贝多糖的生物活性
• 1.2 海洋生物多糖的分离纯化的研究进展
• 1.2.1 分级沉淀法
• 1.2.2 膜分离法
• 1.2.3 色谱分离法
• 1.2.4 制备性区域电泳
• 1.2.5 其他方法
• 1.3 紫贻贝的研究现状
• 1.4 本课题的选题背景与研究意义
• 1.5 本课题的研究内容和研究思路
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 研究思路
• 第2章 热水提取紫贻贝粗多糖工艺优化
• 2.1 材料和仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 紫贻贝粗多糖提取工艺
• 2.2.2 单因素实验
• 2.2.3 响应面法优化紫贻贝粗多糖提取工艺条件
• 2.2.4 基本成分的测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 单因素实验
• 2.3.2 响应面法优化紫贻贝粗多糖提取工艺
• 2.3.3 基本成分的测定
• 2.4 小结
• 第3章 紫贻贝粗多糖的脱蛋白工艺研究
• 3.1 材料和仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 蛋白质含量的测定
• 3.2.2 透析
• 3.2.3 紫贻贝多糖脱蛋白方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Bradford法测蛋白含量的标准曲线
• 3.3.2 Sevag法脱蛋白试验结果
• 3.3.3 酶法脱蛋白最优工艺条件的确定
• 3.3.4 酶法与Seveg联用法脱蛋白的工艺
• 3.4 小结
• 第4章 紫贻贝多糖的纯化及鉴定
• 4.1 材料和仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 紫贻贝多糖MES-I的分离、纯化工艺
• 4.2.2 超滤初步分离MES-I
• 4.2.3 离子交换层析
• 4.2.4 凝胶过滤层析
• 4.2.5 紫贻贝多糖的纯度鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 超滤初步分离MES-I结果
• 4.3.2 离子交换层析结果
• 4.3.3 凝胶过滤层析结果
• 4.3.4 多糖组分的纯度鉴定
• 4.4 小结
• 第5章 紫贻贝精多糖的理化性质与结构研究
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 理化性质分析
• 5.2.2 红外光谱分析
• 5.2.3 单糖组成分析
• 5.2.4 核磁共振测定
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 理化性质分析
• 5.3.2 红外光谱分析
• 5.3.3 单糖组成分析
• 5.3.4 核磁共振分析
• 5.4 小结
• 第6章 紫贻贝多糖的免疫抗肿瘤活性研究
• 6.1 材料与仪器
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验仪器
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 T、B淋巴细胞体外免疫实验
• 6.2.2 K562肿瘤细胞增殖抑制作用实验
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 T、B淋巴细胞体外免疫实验
• 6.3.2 K562肿瘤细胞增殖抑制作用实验
• 6.4 小结
• 第7章 结论、创新点和存在问题
• 7.1 结论
• 7.2 创新点
• 7.3 存在问题
• 参考文献
• 附录一 研究生期间发表的论文
• 致谢