双孢蘑菇基质降解能力退化分子机理的初步研究

论文摘要

双孢蘑菇[Agaricus bisporus （J.E.Lange） Imbach]是世界性栽培与消费的食用菌,具有重要的经济价值和生态意义。As2796是我国多年来唯一的双孢蘑菇主栽品种,对其退化现象的分子机理研究具有重要的理论和实践意义。在本课题中,我们应用As2796正常菌株及其两个基质降解能力退化突变体菌株2796-3、2796-5作为比较研究的对象。主要研究内容和结果如下:（1）对双孢蘑菇2个基质降解能力退化菌株进行多代的无性繁殖（转管）试验及退化性状检测,确定了该退化现象可以稳定存在。对正常与退化菌株进行了混合接种试验,排除了病毒等微生物感染的因素,证明了该退化性状应是基因变异所引起的。进行了不同液体培养基的设计与培养,获得3个菌株在4种培养基中的12个菌丝体样品进行后续的研究。（2）对双孢蘑菇As2796及其分解基质能力退化菌株2796-3、2796-5的总DNA进行了153对引物组合的SRAP分析,结果未能发现两类菌株DNA水平的差异。根据试验结果推测,该退化变异的范围较窄,有可能是个别基因的突变,因而在DNA水平上难以发现。（3）应用同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术对4种不同液体培养基培养的双孢蘑菇As2796及其基质降解能力退化菌株2796-3、2796-5的菌丝体进行了分析,结果发现在部分培养基中正常与退化菌株的酯酶（EST）和多酚氧化酶（PPO）同工酶表型有明显差异,且2个退化菌株的同工酶表型变异一致,说明双孢蘑菇基质降解能力的退化与同工酶活性存在相关性。（4）对4种不同液体培养基培养的双孢蘑菇As2796及其基质降解能力退化菌株2796-3、2796-5进行了24对引物组合的mRNA差异显示（DDRT-PCR）分析,结果发现8对引物组合扩增出可重复的差异,并克隆了9条差异片段。序列分析结果显示9条差异片段代表了5个基因的差异,部分与不同生物的ATP结合盒式运输亚家族A某蛋白、碳水化合物酯酶家族4蛋白、几丁质脱乙酰基酶、乙酰木聚糖酯酶II及其它一些未知蛋白具有较高的同源性。（5）构建了双孢蘑菇As2796菌株的全长cDNA文库,文库初始库容达3.3x106 cfu/mL,插入片段长度范围约0.7-4.0Kb,平均长度约1.5Kb,重组率约82%,全长率约35%。文库扩增出了DDRT-PCR的5个差异基因全长编码序列（CDS）,表明了该文库的有效性,今后可用于扩增所需的双孢蘑菇正常基因的全长cDNA或CDS。（6）以双孢蘑菇As2796及其2个退化菌株的总DNA为模板,扩增出了DDRT-PCR中5个差异片段所在基因带内含子的编码序列及其上游约1200bp调控序列并进行克隆与测序比较,结果表明这些基因与上游序列在三个菌株中并无实质性差异,据此推测退化性状更可能是调控蛋白基因变异所引起的。（7）对双孢蘑菇总蛋白质的双向电泳（2-DE或2D-PAGE）条件进行了摸索与优化,建立了双孢蘑菇蛋白质的2D-PAGE技术,获得了清晰的2D-PAGE图谱。结果表明双孢蘑菇的蛋白质大部分集中在分子量20-120KDa、等电点pI5.2-7.8的范围内。（8）对双孢蘑菇As2796及其基质降解能力退化菌株2796-3、2796-5进行了2D-PAGE分析,发现了2个明显的、可重复的差异蛋白质,在退化菌株中分别为上调和下调表达,且2个退化菌株表现一致。根据质谱（MALDI-TOF-MS）分析和数据库检索结果,2个差异蛋白质初步鉴定为肌动蛋白和NADH脱氢酶铁硫蛋白3,它们与细胞内信号传导或转录调控等过程关系密切。本研究首次发现了一些与双孢蘑菇基质降解能力退化相关的基因片段与蛋白质（酶）,基于本研究结果提出双孢蘑菇基质降解能力退化分子机理是一个多级链式应答（逐级调控）过程的初步设想。即基质降解能力上的退化现象不是单一结构蛋白基因的变异,而可能是调控基因的变异,导致基因表达网络的改变,最终在转录水平、蛋白质水平、细胞水平及生物体上表现出系列差异,造成菌株在基质降解能力上的退化现象。该设想为进一步深入研究双孢蘑菇分解基质能力退化的分子机理奠定了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 双孢蘑菇的遗传和变异
• 2 食用菌基因工程育种研究进展与发展趋势
• 2.1 用于食用菌基因工程育种辅助的分子标记
• 2.2 用于食用菌转化子筛选的选择标记
• 2.3 食用菌基因工程育种转化方法
• 2.4 食用菌基因工程育种发展趋势
• 3 食用菌菌种退化现象及其研究进展
• 4 食用菌基质降解相关酶类及其研究进展
• 5 本研究相关技术及在食用菌研究中的应用
• 5.1 序列相关扩增多态性（SRAP）
• 5.2 同工酶电泳
• 5.3 mRNA 差异显示（DDRT-PCR）
• 5.4 蛋白质双向电泳（2D-PAGE）
• 6 本研究的背景、意义及主要内容
• 6.1 本研究的背景及意义
• 6.2 本研究的主要内容
• 第二章 双孢蘑菇基质降解能力退化菌株的保藏、培养与性状验证
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌株的保藏
• 1.2.2 菌丝的培养
• 1.2.3 混合接种试验
• 2 结果与分析
• 2.1 退化性状验证
• 2.2 退化原因验证
• 2.3 液体培养试验
• 3 讨论
• 第三章 双孢蘑菇基质降解能力退化的SRAP 分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 引物
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌丝的培养
• 1.2.2 总DNA 的提取
• 1.2.3 SRAP 分析
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第四章 双孢蘑菇基质降解能力退化的同工酶分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌丝的培养
• 1.2.2 电泳样品的制备
• 1.2.3 电泳方法
• 1.2.4 染色方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第五章 双孢蘑菇基质降解能力退化的 DDRT-PCR 分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 引物
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌丝的培养
• 1.2.2 总 RNA 的提取
• 1.2.3 总RNA的变性凝胶电泳
• 1.2.4 m RNA 逆转录
• 1.2.5 DDRT-PCR 分析
• 1.2.6 差异片段的重新扩增
• 1.2.7 全长cDNA 文库的构建与鉴定
• 1.2.8 特异基因与片段的扩增
• 1.2.9 目的差异DNA片段的纯化、克隆与鉴定
• 1.2.10 克隆子测序与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 双孢蘑菇 As2796 及其退化菌株的总 RNA 提取及检测
• 2.2 双孢蘑菇As2796 及其退化菌株的DDRT-PCR 分析
• 2.3 差异条带的克隆、测序与同源性检索
• 2.4 双孢蘑菇全长cDNA 文库的构建及差异基因CDS 的扩增
• 2.5 差异基因及上游序列的克隆、测序及比较
• 3 讨论
• 第六章 双孢蘑菇基质降解能力退化的2D-PAGE 分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌丝的培养
• 1.2.2 蛋白质的提取
• 1.2.3 蛋白质的定量
• 1.2.4 蛋白质双向电泳
• 1.2.5 凝胶染色（胶体考马斯蓝G-250）
• 1.2.6 凝胶扫描与分析
• 1.2.7 质谱分析与数据库检索
• 2 结果与分析
• 2.1 双孢蘑菇总蛋白质的提取
• 2.2 双孢蘑菇蛋白质2D-PAGE 技术的建立
• 2.3 双孢蘑菇 As2796 及其退化菌株的2D-PAGE 分析
• 2.4 差异蛋白质点的质谱分析与鉴定
• 3 讨论
• 第七章 结论与展望
• 1 研究总结
• 2 特色与创新点
• 3 下一步研究计划
• 参考文献
• 附录1 DDRT-PCR 差异基因的CDS 及预测的蛋白质序列
• 附录2 DDRT-PCR 差异基因及上游序列在三个菌株中的比较
• 附录3 博士期间发表的论文与承担的课题
• 致谢