栽培稻抗旱性状评价与定位及其育种应用

论文摘要

干旱是世界农业生产的主要障碍之一,水稻是世界上主要耗水作物,水稻抗旱性的研究对粮食增产增收具有重要意义。建立科学有效的抗旱性评定方法和鉴定体系,定位与克隆水稻抗旱性相关的基因,利用分子标记辅助选择和转基因技术,结合常规育种,进行节水抗旱、优质高产多抗等性状的聚合,培育节水抗旱新品种是水稻抗旱性研究的主要内容。本研究对可能的抗旱鉴定指标穗颈粗和穗水势进行了分析,利用抗旱群体材料对抗旱性状进行分子标记定位,并通过标记辅助选择技术构建了4个抗旱目标区段的近等基因系,精细定位了部分相关主效OTL,通过候选基因法克隆了其中一个可能的抗旱相关基因QsGRAS,并将来源于第4染色体的目标区段导入到早稻保持系中,获得了稳定株系。主要结果如下:1.穗水势:调查生育后期进行干旱处理的3个品种（2个旱稻和1个水稻）在晴天每隔1-1.5h一天内穗水势和叶水势的变化,发现旱稻品种的穗水势和叶水势比水稻品种开始下降要慢,比水稻品种保持更高的水平且恢复更快。在晴天中午,穗水势和叶水势在旱稻和水稻间的差异甚至在正常水分条件下也能观察到。穗水势和叶水势与关乎植株生长和植株产量组成因子的7个性状存在相似的相关性。基于穗水势和叶水势日变化的的平行趋势及两者间的高度相关,提出穗水势可以作为植株水分状况的一个指标,穗水势能更有效区分不同旱稻品种的抗旱性差异。2.穗颈粗及种质创新:调查以珍汕97B和IRAT109构建重组自交系群体在不同水分处理下的穗颈粗,发现穗颈粗与很多农艺性状,尤其是穗型极显著相关。通径分析表明两种水分条件下穗颈粗主要是通过颖花数或实粒数来对产量产生影响。基于213个SSR标记构建的连锁图谱,总共检测到3个控制穗颈粗的主效QTL,其中qPND-4在两种水分条件下都检测到,贡献率为5.03%.11.01%。在第4染色体RM241-RM349标记区间,共定位到7个穗型相关的QTL,控制穗数、穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗颖花数、着粒密度和每穗实粒数。共检测到17个与穗颈粗有关的上位性QTL,贡献率变异为2.58%-5.64%。通过杂交和连续回交,利用分子标记辅助选择技术对前景进行筛选,将IRAT109的第4染色体区段导入到旱稻不育系沪旱1A的保持系沪旱1B中,抗旱性鉴定发现,导入的材料在实粒数、穗颈粗和产量上有显著提高。3.近等基因系构建与QsGRAS基因克隆:立足于两年定位结果中5个控制较多抗旱相关性状的QTL区段,通过杂交和回交,并利用分子标记对前景和背景进行选择,构建目标区段来源于早稻IRAT109而其余背景均为水稻珍汕97B的近等基因系。对其中4个区段的近等基因系进行了抗旱性鉴定,在干旱条件下导入有OTL区段的近等基因系在产量和结实率上均高于珍汕97B。对第4染色体的RM273-RM255和第7染色体的RM134-RM420通过加密SSR和ILP标记,将控制实粒数和产量的OTL缩小到95kb,穗数和颖花数的QTL定位在609kb的区间内,结实率定位在227kb的范围内。第7染色体上影响实粒数和结实率的QTL定位在83kb的区间内,而控制颖花数和实粒数的则定位在446kb范围内。对精细定位的区段内的候选基因进行了初步的分析。并根据候选基因cDNA序列,设计引物,扩增获得OsGRAS的编码cDNA和启动子序列。对其保守区域进行分析,发现OsGRAS是GRAS转录因子家族的一个成员,其具有该家族典型的结构域。通过酶切及载体连接,共构建了OsGRAS基因及其启动子相关的三个表达载体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略名词表
• 1 文献综述
• 1.1 水稻抗旱研究的重要意义
• 1.2 抗旱性的含义
• 1.3 抗旱性的生理基础
• 1.3.1 叶片形态结构与抗旱
• 1.3.2 气孔对干旱的反应
• 1.3.3 根系发育特性与抗旱
• 1.3.4 渗透调节与抗旱
• 1.4 抗旱性的分子生物学基础
• 1.4.1 水分胁迫诱导蛋白与抗旱
• 1.4.2 植物抗旱的信号转导
• 1.5 抗旱性的鉴定技术体系
• 1.5.1 抗旱性鉴定指标
• 1.5.2 抗旱性鉴定的数量分析方法
• 1.6 抗旱性研究方法
• 1.6.1 田间或干旱棚鉴定法
• 1.6.2 实验室鉴定法
• 1.7 抗旱遗传育种
• 1.7.1 抗旱性的遗传特性
• 1.7.2 抗旱性遗传改良
• 1.7.3 抗旱育种选择策略与技术
• 1.8 抗旱的分子标记辅助选择
• 1.8.1 分子标记的类型及原理
• 1.8.2 抗旱相关性状的QTLs定位
• 1.8.3 分子标记技术在抗旱育种中的应用
• 1.9 抗旱基因工程育种
• 1.9.1 图位克隆法
• 1.9.2 旱诱基因的反向遗传学分离克隆方法
• 1.9.3 基因遗传转化技术
• 1.9.4 抗旱基因工程存在的问题与展望
• 2 本研究的目的和意义
• 3 穗水势与抗旱性的关系
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果分析
• 3.2.1 两种水分胁迫下三个品种的表现
• 3.2.2 穗水势（PWP）和叶水势（LWP）的日变化
• 3.2.3 穗水势和叶水势与产量及一些性状的相关
• 3.3 讨论
• 3.3.1 测定PWP鉴定水稻抗旱性
• 3.3.2 干旱和非干旱胁迫下早稻和水稻品种的水分状态
• 4 穗颈粗的遗传分析及MAS种质创新
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 田间试验设计
• 4.1.3 干旱处理
• 4.1.4 性状调查
• 4.1.5 遗传连锁图谱构建
• 4.1.6 MAS方法
• 4.2 结果和分析
• 4.2.1 亲本及群体的性状表现
• 4.2.2 穗颈粗与其它农艺性状的相关及通径分析
• 4.2.3 穗颈粗主效QTL的定位分析
• 4.2.4 上位性互作位点分析
• 4.2.5 导入区段的选择
• 3F₂性状表现'>4.2.6 沪旱1B导入系BC₃F₂性状表现
• 3F₂性状的相关'>4.2.7 沪旱1B导入系BC₃F₂性状的相关
• 4.3 讨论
• 4.3.1 穗颈粗与穗型大小
• 4.3.2 穗颈粗与抗旱性
• 4.3.3 QTL紧密连锁或一因多效
• 4.3.4 抗旱区段比较
• 4.3.5 导入效应与抗旱定位效应的一致性
• 4.3.6 导入区段的抗旱性效应
• 4.3.7 利用MAS导入数量性状QTL的可行性
• 5 近等基因系的构建及候选基因克隆
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 选定的抗旱目标QTL区段
• 5.1.2 含目标区段株系的选择
• 5.1.3 杂交及回交
• 5.1.4 近等基因系的构建
• 5.1.5 近等基因系性状测定
• 5.1.6 基因克隆所需酶和其它试剂
• 5.1.7 所用菌株和载体
• 5.1.8 旱稻IRAT109总RNA提取及DNA提取
• 5.1.9 RT-PCR扩增编码cDNA
• 5.1.10 启动子的扩增
• 5.1.11 定量PCR
• 5.1.12 植物表达载体的构建
• 5.2 结果
• 3F₂植株的基因型'>5.2.1 BC₃F₂植株的基因型
• 3F₃基因型和表型的关系'>5.2.2 BC₃F₃基因型和表型的关系
• 5.2.3 候选基因筛选
• 5.2.4 OsGRAS基因的扩增、克隆和测序
• 5.2.5 OsGRAS基因在两亲本间的差异
• 5.2.6 OsGRAS保守区域分析
• 5.2.7 定量PCR结果
• 5.2.8 构建OsGRAS的表达载体
• 5.2.9 关系树分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 选定的目标区段相关基因的共定位
• 5.3.2 高世代回交群体定位"隐蔽基因"
• 5.3.3 近等基因系构建中可能存在的问题
• 5.3.4 关于候选基因
• 5.3.5 OsGRAS为抗旱响应基因
• 参考文献
• 附录
• 附录Ⅰ 植物DNA提取步骤
• 附录Ⅰ-1 大样法（改良CTAB法）
• 附录Ⅰ-2 小样法
• 附录Ⅰ-3 小样改进法
• 附录Ⅱ SSR反应体系和扩增
• 附录Ⅲ 电泳检测
• 附录Ⅲ-1 琼脂糖电泳检测
• 附录Ⅲ-2 PAGE电泳检测
• 附录Ⅴ 感受态细胞制备及转化
• 附录Ⅵ OsGRAS基因的编码序列和启动子序列
• 附录Ⅵ-1 OsGRAS基因的编码cDNA序列
• 附录Ⅵ-2 OsGRAS启动子序列
• 作者简历
• 致谢