果蝇血液发育候选基因CG8419的相互作用蛋白研究

论文摘要

心血管疾病严重危害人类的健康。心血管发育是一个复杂的过程,受一系列转录因子的精确调控。从分子水平上系统地研究控制心血管发育及相关基因的相互调控关系,有助于人们深入认识心血管疾病发生的机制。果蝇CG8419基因是是本室克隆鉴定的人类Trim45基因的同源基因,该基因在进化上具高度保守性。本室前期利用果蝇模型进行研究的结果表明,CG8419可能与果蝇血细胞形成有关。本文研究前期通过酵母双杂交实验筛选到的CG8419基因的2个候选相互作用蛋白CG9090及mrj。本研究首先将果蝇CG8419, CG9090和mrj基因的开放阅读框克隆到pMD18一T载体中,经酶切和测序证实后,再分别构建成真核表达质粒pCMV-tag2B-CG8419, pCMV-myc-CG9090和pCDNA3.1B-mrj,分别转染HEK293细胞,通过免疫共沉淀技术研究这3个基因的相互作用情况。结果表明,全长的CG8419基因与CG9090, CG8419与mrj均具有相互作用。为了进一步研究CG8419基因的具体相互作用位点,将CG8419亚克隆成质粒pCMV-tag2B-Ring, pCMV-tag2B-RB2, pCMV-tag2B-RB 1 pCMV-tag2B-B2F, pCMV-tag2B-B1F和pCMV-tag2B-FLMN。CG8419亚克隆与CG9090及mrj的免疫共沉淀结果表明,CG8419通过B-BOX结构域与CG9090及mrj相互结合,此外Ring结构域也具有一定的作用。CG9090亚克隆片段与CG8419的免疫共沉淀实验表明,CG9090通过Pfam:Mitocarr结构域与CG8419发生相互作用。Mrj亚克隆片段与CG8419免疫共沉淀实验表明,mrj通过DnaJ结构域与CG8419发生相互作用。综上所述,CG8419主要通过B-BOX结构域与CG9090和mrj相互作用,CG9090通过Pfam:Mitocarr结构域与CG8419相互作用,mrj通过DnaJ结构域与CG8419发生相互作用。该研究为进一步研究CG8419在果蝇血细胞形成中的调控机制打下了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言和文献综述
• 引言
• 1.1 果蝇的血液发育
• 1.1.1 果蝇血细胞来源
• 1.1.2 血液前体细胞种类
• 1.1.3 血液发育相关基因
• 1.1.4 血细胞生成相关信号途径
• 1.2 锌指蛋白转录因子在血液发育中的调控作用
• 1.2.1 锌指蛋白家族
• 1.2.2 血液发育过程中锌指蛋白转录因子的功能
• 1.3 本文研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 生物信息学软件
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 质粒、细胞和菌株
• 2.1.4 主要实验仪器和耗材
• 2.2 方法
• 2.2.1 CG8419、CG9090、mrj基因的生物信息学分析
• 2.2.2 引物设计与合成
• 2.2.3 PCR扩增
• 2.2.4 PCR产物纯化回收
• 2.2.5 载体连接实验
• 2.2.6 感受态细胞的制备
• 2.2.7 连接产物的转化
• 2.2.8 质粒的小量制备
• 2.2.9 阳性克隆的筛选与鉴定
• 2.2.10 测序
• 2.2.11 重组质粒的构建
• 2.2.12 常规细胞培养及转染
• 2.2.13 细胞总RNA提取
• 2.2.14 反转录
• 2.2.15 荧光定量PCR
• 2.2.16 统计学分析
• 2.2.17 细胞总蛋白的提取
• 2.2.18 Western blot
• 2.2.19 免疫共沉淀
• 第三章 实验结果及其分析
• 3.1 果蝇CG8419基因的生物信息学分析、载体构建及初步表达分析
• 3.1.1 果蝇CG8419生物信息学分析
• 3.1.2 CG8419基因亚克隆及载体构建
• 3.1.3 Real-Time PCR验证CG8419及亚克隆片段表达
• 3.1.4 western blot验证CG8419及亚克隆片段表达
• 3.2 果蝇CG9090基因的生物信息学分析、载体构建及初步表达分析
• 3.2.1 果蝇CG9090生物信息学分析
• 3.2.2 CG9090基因亚克隆及载体构建
• 3.2.3 Real-Time PCR验证CG9090及亚克隆片段表达
• 3.2.4 western blot验证CG9090及亚克隆片段表达
• 3.3 果蝇mrj基因的生物信息学分析、载体构建及初步表达分析
• 3.3.1 果蝇mrj生物信息学分析
• 3.3.2 mrj基因及其亚克隆片段载体构建
• 3.3.3 Real-Time PCR验证mrj表达
• 3.3.4 western blot验证mrj及亚克隆片段表达
• 3.4 免疫共沉淀验证果蝇CG8419与果蝇CG9090相互作用
• 3.4.1 果蝇CG8419与果蝇CG9090存在相互作用
• 3.4.2 果蝇CG8491主要通过B-BOX结构域与果蝇CG909O发生相互作 用
• carr结构域与果蝇CG8419发生相互作用'>3.4.3 果蝇CG9090通过Pfam:Mito_carr结构域与果蝇CG8419发生相互作用
• 3.5 免疫共沉淀验证果蝇CG8419与果蝇mrj相互作用
• 3.5.1 果蝇CG8419与果蝇mrj存在相互作用
• 3.5.2 果蝇CG8419主要通过B-BOX结构域与果蝇mrj发生相互作用
• 3.5.3 果蝇mrj通过DnaJ结构域与果蝇CG8419发生相互作用
• 3.6 讨论
• 结语
• 第四章 其它工作
• 4.1 斑马鱼ANF基因背景资料介绍
• 4.2 ANF基因克隆至表达载体
• 4.3 ANF融合蛋白诱导表达及纯化
• 4.4 ANF多克隆抗体效价检测
• 4.5 ANF多克隆抗体特异性检测
• 4.6 western blot检测ANF组织表达
• 4.7 讨论
• 参考文献
• 附录
• 后记