掺杂细胞色素c的酶界面的构建及其生物传感研究

论文摘要

基于蛋白质界面构建的电化学传感器具有选择性高、分析速度快、操作简单、价格低廉和可进行在线甚至活体检测等优点，在工业控制、环境监测、食品检测和重大疾病诊断等方面均有重要应用价值。探索合适的方法设计蛋白质界面以实现它的信号转换是该领域研究的重点和难点。采用具有良好生物相容性和导电性的材料构建既有利于保持蛋白质的活性又能有效地转移电子的界面，既能使氧化还原蛋白质与电极进行快速的电子交换，又能发展响应快、灵敏度高的电化学传感器。沿着这条思路，本研究以细胞色素c（Cyt c）为模型蛋白质，致力于发展新型材料固定方法，以达到改进固定生物材料活性、延长传感器使用寿命等目的，进一步构筑Cyt c和辣根过氧化物酶（HRP）的双蛋白质界面以揭示蛋白质间的相互作用机理和信息传递规律，并发展更灵敏的电化学传感元件。具体开展的研究工作如下：1.基于PDDA-Gp-Au复合材料的Cyt c直接电化学及其电化学生物传感研究。利用聚二烯丙基二甲基氯化铵（简写为PDDA）为还原剂还原氧化石墨烯（GO），制备PDDA功能化的石墨烯（Gp），并在其原位生长金纳米颗粒（AuNPs），得到了PDDA-Gp-Au纳米复合物。此处掺入的PDDA可以作为“粘合”分子使石墨烯片层结构转而成为一个可原位生长Au NPs的平台，还可用作制备石墨烯纳米片胶态分散液的稳定剂。该复合物由于Gp和Au NPs的协同作用，具有良好的导电性和生物兼容性。将其用来构筑Cyt c修饰电极，并详细研究了Cyt c在该复合物内的直接电化学和电催化特性。实验结果表明，PDDA-Gp-Au纳米复合物可有效固载Cyt c分子，Gp和Au NPs的引入对Cyt c的直接电子转移发挥了较好的协同促进作用，且Cyt c/RTIL-Au-Gp-PDDA/MUA-MCH/Au电极对过氧化氢（H2O2）表现出优良的催化活性，可用作检测H2O2的传感器。2.基于PFS-DNA复合膜的Cyt c直接电化学及其生物传感器。DNA是一种生物大分子，其碱基对的堆积排列可看作是能够实现电子转移的共轭π电子体系，能促进其他电活性物质的电子转移。它能与带正电荷且具有电活性的聚电解质聚二茂铁硅烷（PFS）形成一种三维（3D）多孔结构，该孔状结构可用来固载具有堆垛结构的物质并用作生物兼容的母体。将Cyt c固载在PFS-DNA复合物的3D多孔膜中，研究Cyt c在多孔膜中的直接电化学和电催化特性。结果显示，PFS-DNA膜的3D多孔结构为Cyt c提供了良好生物兼容的微环境，促进了Cytc的直接电子转移；且Cyt c/PFS-DNA/Au电极展示了优良的生物电催化还原H2O2的特性，因此，可用作检测H2O2的传感器。3.基于GO-壳聚糖（CHIT）修饰的Cyt c和HRP的双蛋白质界面的电子传递的研究。此设计中，将具有良好生物兼容性的CHIT与具有良好电子传导性的GO制成纳米复合物用作电化学研究平台以固载双蛋白质。即利用GO-CHIT复合物来固载Cyt c和HRP混合蛋白质，构筑掺杂Cyt c的双蛋白质界面，研究双蛋白质在界面中的电子传递和其电催化特性。结果显示，双蛋白质体系能够与电极之间实现直接电子转移，电子传递速率为ks,（Cyt c-HRP）=2.63s-1，比Cyt c和HRP单蛋白质修饰电极都大(ks,（Cyt c）=1.44s-1, ks,（HRP）=1.53s-1)。此外，双蛋白质修饰电极展示了优良的生物电催化还原O2和H2O2的特性，有望应用于O2和H2O2的检测。4. Cyt c-HRP与GO-CHIT自组装多层膜的制备及其电化学传感研究。利用LBL技术将Cyt c单层膜电极交替地浸入GO-CHIT溶液和Cyt c-HRP溶液中组装制成双蛋白质多层膜修饰电极。使用紫外光谱和电化学交流阻抗谱（EIS）研究了多层膜电极的构建过程。重点考查了组装层数对双蛋白质相互作用以及电子传输的影响，比较了双蛋白质多层膜界面与单蛋白质多层膜界面性能的异同，揭示蛋白质界面中信息的传递规律。并研究了双蛋白质多层膜界面对电催化还原O2的性能。结果显示，双蛋白质在GO-CHIT膜中实现了层层组装，并保持了其生物电活性，在低扫描速率下对O2的电催化性能优越。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 生物传感器概述
• 1.1.1 基本原理
• 1.1.2 生物传感器分类
• 1.2 电化学生物传感器
• 1.2.1 电化学生物传感器概述
• 1.2.2 电化学生物传感器分类
• 1.2.2.1 酶电极传感器
• 1.2.2.2 电化学免疫传感器
• 1.3 基于 Cyt c 的电化学生物传感器的研究
• 1.3.1 Cyt c 简介
• 1.3.2 基于 Cyt c 的电化学生物传感研究概况
• 1.4 生物分子固化技术
• 1.4.1 吸附法
• 1.4.2 包埋法
• 1.4.3 交联法
• 1.4.4 共价键合法
• 1.4.5 电化学聚合法
• 1.5 电化学生物传感器的固定基质材料
• 1.5.1 石墨烯基复合材料在电化学生物传感器中的应用
• 1.5.1.1 石墨烯材料及其在电化学生物传感器中的应用
• 1.5.1.2 石墨烯基材料在电化学生物传感器中的应用
• 1.5.2 导电聚合物在电化学生物传感器中的应用
• 1.6 本论文的研究目的和意义
• 参考文献
• 第二章 细胞色素 c 基于 PDDA-Gp-Au 复合材料的直接电化学及其生物传感研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.2.3 PDDA-Gp-Au 纳米复合物的制备
• 2.2.4 修饰电极的制备
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 复合材料 PDDA-Gp-Au 的紫外光谱表征
• 2.3.2 复合材料 PDDA-Gp-Au 的形貌表征
• 2.3.3 Cyt c/ RTIL-Au-Gp-PDDA /MUA-MCH/Au 的电化学性能
• 2O₂）的电催化行为'>2.3.4 Cyt c/RTIL-Au-Gp-PDDA/MUA-MCH/Au 电极对过氧化氢（H₂O₂）的电催化行为
• 2.4 结论
• 参考文献
• 第三章 基于 PFS-DNA 复合膜固载的细胞色素 c 的直接电子传递及其生物传感研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 修饰电极的制备
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 PFS-DNA 复合膜和 Cyt c 相互作用的光谱分析
• 3.3.2 Cyt c 在 PFS-DNA/Au 电极上的直接电化学
• 2O₂）的电催化行为'>3.3.3 Cyt c/PFS-DNA/Au 电极对过氧化氢（H₂O₂）的电催化行为
• 3.4 结论
• 参考文献
• 第四章 氧化石墨烯-壳聚糖/细胞色素 c 和辣根过氧化物酶双酶界面的构筑及电子传递的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 实验仪器
• 4.2.3 壳聚糖-氧化石墨烯纳米复合物的制备
• 4.2.4 HRP-Cyt c/GO-CHIT/Cyt c/MUA-MCH/Au 电极的制备
• 4.2.5 用于 UV-vis 光谱测试的样品处理
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 Cyt c 和 HRP 相互作用的光谱表征
• 4.3.2 双蛋白修饰电极的电化学行为
• 2O₂）和氧气（O₂）的电催化'>4.3.3 双蛋白质修饰电极对过氧化氢（H₂O₂）和氧气（O₂）的电催化
• 4.3.4 双蛋白质传感器的选择性
• 4.3.5 双蛋白质传感器的重现性和稳定性
• 4.4 结论
• 参考文献
• 第五章 GO-CHIT 与 Cyt c-HRP 多层膜的制备及其电化学传感应用
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 试剂
• 5.2.2 实验仪器
• 5.2.3 壳聚糖-氧化石墨烯纳米复合物的制备
• 5.2.4 {GO-CHIT/Cyt c-HRP}n层层自组装膜的组装
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 {GO-CHIT/Cyt c-HRP}n层层组装膜的紫外光谱和 EIS 表征
• 5.3.2 不同组装层数时{GO-CHIT/Cyt c-HRP}n修饰电极的 CVs
• 5.3.3 组装层数相同时双蛋白质和单蛋白质修饰电极的 CVs
• 2）的电催化研究'>5.3.4 多层膜修饰电极{GO-CHIT/Cyt c-HRP}n对氧气（O₂）的电催化研究
• 5.4 结论
• 参考文献
• 论文总结
• 致谢
• 在读期间公开发表论文及科研情况