论文摘要
小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica,简称Y.e）是自20世纪80年代以来引起国际上广泛注意的一种食源性传播病原菌,广泛分布于自然界,已从人、动物、土壤、水、和多种食品中分离出来。Y.e是能在冷藏温度下生长的少数肠道致病菌之一,全球由该菌引起的食源性疾病爆发已有数十起。本菌致病后临床表现主要为两种:胃肠型症状和肠道外感染。目前本菌的检测主要依靠实验室培养,包括冷增菌法和选择性增菌法。两种方法所需培养时间长且繁琐,最后还需要做十几种生化试验鉴定。结果往往在一周以后才有,延误了疾病的诊断。国外开展了利用分子生物学及免疫学方法对Y.e进行检测的研究,包括定性分析的PCR技术、探针技术、ELISA及免疫磁珠等,但这些方法一般用于对纯菌的快速筛选,尚没成熟应用于检测腹泻粪便中的Y.e。因此,此次研究设想应用实时定量PCR建立快速准确的临床诊断方法。研究目的:建立一种快速准确的方法检测腹泻粪便中小肠结肠炎耶尔森氏菌,并应用于临床检测中。材料和方法:1.收集住院和门诊腹泻病人的粪便200例及正常人粪便50例。2.应用四种培养方法（YSE-CIN、PBSS-SS、PAE-NYE、PAE-DYS）同时鉴定250例粪便是否含有小肠结肠炎耶尔森氏菌。利用Cohran’s Q检验分析多个相关样本,4种方法检出率的比较采用配对设计的卡方检验。3.应用针对致病性Y.e染色体上耐热肠毒素基因（yst）而设计的引物和探针进行实时定量PCR反应（探针法）,检测致病性（7种血清型）和非致病性（5种）小肠结肠炎耶尔森氏菌、耶尔森菌属内的其他菌种（8种）及其他肠道细菌（8种）,以检验其特异性。通过对Y.e纯培养物和外加Y.e粪便的倍比稀释,以检测引物和探针的敏感性。4.选择性增菌后提取250例粪便的DNA,并应用此引物和探针进行检测。最后比较real-time PCR和培养方法结果的吻合度。结果:1.改良的培养方法（YSE-CIN）从200例腹泻粪便中检测到18例含有致病性Y.e,另外3种传统方法（PBSS—SS法、PAE—NYE法、PAE—DYS法）的阳性例数分别为3、5、8。利用Cohran’s Q检验分析多个相关样本,得出Q=26.6,P=0.000＜0.05。经配对设计卡方检验,改良方法分别与其它3种方法的检出率具有显著性差异。4种方法从50例正常粪便中均无检测出Y.e。2.引物和探针对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌100%特异,与其他细菌无交叉反应。在纯培养物和粪便中,最低检测浓度分别约为102CFU/ml和103CFU/g。3.在200例腹泻粪便中,real-time PCR检出18例阳性样本,与改良培养方法一致。增菌后粪便中Y.e的浓度主要集中在约105-108CFU/g。从50例正常粪便中没有检出Y.e。结论:1.改良培养方法比其他3种培养方法的检出率更高,可在普通医院中应用。2.引物和探针对致病性Y.e的yst基因高度特异。敏感性试验表明,引物和探针的最低检测浓度能够应用于临床检测中。3.实时定量PCR快速方便,结果可靠,故相对其他方法更合适应用于临床检测中。
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标签：实时定量论文; 腹泻论文; 小肠结肠炎耶尔森氏菌论文;