PLK1和mTOR激酶在小鼠受精卵早期发育中作用的研究

论文摘要

前言对受精卵这一天然的细胞周期模型进行深入研究,有利于揭示细胞周期的调控机制,对生长、发育、癌变、死亡有进一步认识。小鼠受精卵是脊椎动物中与人类种属较为接近的细胞周期模型,但由于取材有限,关于小鼠受精卵早期发育机制的研究,尤其是1细胞期向2细胞期转换,即G2/M期转换机制的研究进展缓慢,因此也成为国际上研究的热点之一。Plks激酶（Plks）是广泛存在于真核生物中的一类丝/苏氨酸蛋白激酶,Plks家族成员较多。在Plks家族中果蝇polo基因是最早被发现的。后来又发现了酿酒酵母（saccharmyces cervisiae）中的cdc5p激酶,芽殖酵母（shizosacchermyces pombe）中的polo1激酶,爪蟾（Xenopus）中的Plx1,高等脊椎动物的Plk1,小鼠中的Snk和Fnk,以及人细胞中的hSnk和prk等。在有丝分裂过程中的不同的几个时期都需要Plks的作用,Plks的活性随时间的变化可以支持这一观点。在哺乳动物细胞Plk1的活性在G2/M转换期迅速增高,几乎与CDK1的活性同时增高。但其活性在CDK1的活性下降后仍保持较高水平。小鼠卵中生发泡破裂（GVBD）前30分钟,Plk1的活性开始升高,在GVBD时达到最高,此后Plk1的活性略有下降,但是在卵的整个成熟过程中仍能保持较高的活性。乙醇活化发生孤雌生殖后Plk1被去磷酸化活性逐渐降低。在进入第一次有丝分裂的M期中的核膜破裂期,Plk1被磷酸化活性有升高。总之,Plks的时空分布、蛋白量及活性变化与其功能密不可分。在G2/M转换期,Plk据记载定位于SPB周围,而此时MPF复合体也出现在同一位置,并发现在MPF活化时Plks活性升高,因而推测Plks可能参与了MPF在G2/M转换期的激活过程。在爪蟾Plx1被抗体中和后cdc25和MPF活性受到抑制,假如有活性的cdc25可以逆转此趋势,说明Plx1可能参与了cdc25的激活,进而激活MPF。又发现Plx1的激活略晚于MPF,其活性可被CDK的特异性抑制剂完全抑制,可以推测Plx1的激活也依赖MPF的活性。由此推断MPF可通过激活Plx1间接活化cdc25然后激活更多的MPF,是一个自我催化活化环,并且Plx1参与其中。同时还有研究表明在爪蟾中当Plx1失活时,MPF的抑制性激酶Myt1可被激活而发生超磷酸化,从而抑制cdc2的活化。可以看出Plx1在G2/M转换期既活化了MPF的激活物cdc25又抑制了MPF的抑制物Myt1从而推动了MPF的激活,是细胞分裂进入M期。除了上述的推断外有实验证明Plx1对cdc25的激活作用。Qian（1998）用突变技术将Plx1的Ser125、Thr201残基换为带负电的Asp残基（S128D/T201D）得到有极高Plx1活性的突变体,并将其mRNA注入爪蟾卵中,可直接激活cdc25和MPF。此外Roshak（2000）研究也发现无论免疫共沉淀得到的Plks蛋白还是重组得到的均可直接磷酸化人的cdc25c。近年来,关于Plk1信号转导途径的报道日益增多,但是有关Plk1在哺乳动物受精卵早期发育过程中作用的报道仍然很少。我们前一部分工作对小鼠1-细胞期受精卵中Plk1的表达及其活性进行了初步观察,发现Plk1的表达和活性在小鼠受精卵早期发育的过程中有变化,因此可能参与G2/M期的转换过程,为了作进一步的研究,通过使用Plk1 shRNA和Plk1的特异性抑制剂scytomenin来抑制Plk1的生物学功能,观察Plk1对于受精卵早期发育的作用,及其的作用途径。类帕霉素是从土壤吸湿链球菌中分离出来的一种抗生素,结构与大环内酯类抗生素FK506类似,类帕霉素进入体内后与其受体FKBP12结合,然后与另外一种大分子蛋白结合,形成三联复合体,这种大分子蛋白被称为类帕霉素靶（targetof rapamycin,TOR）。TOR首次从酵母中发现,随后在哺乳动物中也发现了TOR的同源蛋白mTOR。mTOR（mammalian target of rapamycin）蛋白是一结构与功能保守的蛋白质,是磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族成员,具有丝/苏氨酸激酶活性,是调节细胞生长的中心调控因子。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）参与细胞内一系列生理病理过程,其存在形式主要有两种:mTOR/Raptor复合物和mTOR/Rictor复合物。mTOR/Raptor复合物的发现早于mTOR/Rictor复合物,作用主要是通过调节蛋白质的合成影响细胞生长和增殖,其活性能够被雷帕霉素抑制。mTOR/Rictor复合物的活性不能被雷帕霉素抑制,主要参与细胞骨架蛋白的构造,具体功能仍在进一步研究之中。众所周知,PKB是调节细胞增殖的重要因子。有报道显示,PKB可以直接磷酸化GSK-3并使其失活,从而促进cyclin D1的核定位,最终激活Cdk4/cyclin D1复合体,推动G1期进程。另一方面,PKB可以将Cdk的抑制因子p21Waf1/Cip1和p27Kip1磷酸化,导致它们定位于细胞浆,并抑制它们的生理功能。这些结果说明PKB通过激活正性调节因子和失活负性调节因子同时促进G1期进程,完成G1/S期转换。同时,PKB还可以有效的调节M期进程。在Rat-1细胞中使用LY294002抑制P13K的活性以后可以引起G2/M期阻滞;当过表达持续激活型PKB或缺失PTEN时,细胞能克服由于γ射线照射引起的G2/M期阻滞。因此,PKB能有效的促进哺乳动物细胞周期中G2/M期转换。我们实验室的前期工作显示,PKB特别是持续激活型PKB,通过影响Cdc2-Tyr15的磷酸化状态促进MPF的活化,参与了受精卵早期发育到2-细胞期的调节过程。但在小鼠受精卵中,关于mTOR/rictor的作用机制和其信号通路还未见报道。本实验通过观察小鼠1细胞期受精卵中mTOR和PKB的各期活性变化来分析它们之间活性变化的关系,应用Scansite分析软件对小鼠PKB蛋白序列进行分析和预测,并结合现有的mTORC2/PKB的相关报道,确定小鼠PKB蛋白中mTORC2的磷酸化靶位点,通过构建野生型和激酶失活型蛋白激酶B的表达载体及该位点的突变体,并体外转录成mRNA,显微注射入小鼠1细胞期受精卵,来探讨mTORC2在小鼠受精卵早期发育过程中的可能底物及作用位点,同时为揭示小鼠受精卵早期发育机制提供重要依据。材料与方法1、材料与试剂中国医科大学实验动物部提供昆明系雌性小白鼠;Plk1抗体（Santa cruz）,抗兔的辣根过氧化物酶二抗（北京中杉公司）,ECL发光试剂盒（Pierce公司）,快速微量mRNA提取纯化试剂盒（Amersham biosciences公司）,RT—PCR试剂盒（Takara公司）,Scytonemin由Peter Richter博士（Department of PlantEcophysiology,Friedrich-Alexander University Erlangen-Numberg,Germany）馈赠,pU6-Plk1 shRNA和pU6-Plk1 scramble shRNA由Yves Matthess博士（Dept.ofGynecology and Obstetrics,Johann Wolfgang Goethe-University Medical School,Frankfurt）)惠赠,pSUPER-GFP-raptor shRNA和pSUPER-GFP-rictor shRNA由EstellaJacinto教授惠赠,E.coli JM109感受态细菌、氨卞青霉素（Takara公司）LB培养基（Invitrogen）,去内毒素质粒中量提取试剂盒（OMEGA公司）,O-dianidine、β-naphthyl acid phosphate、mTOR及PKB活性测定试剂均为Sigma公司产品。2、小鼠超排卵及受精卵的采集和培养昆明系小白鼠,4～5周龄成熟雌鼠,腹腔注射PMSG 10IU/只,48小时后腹腔注射hCG 10IU/只,当晚与8周龄以上性成熟雄性昆明系小鼠合笼过夜,次日晨检查雌鼠阴栓,由阴栓者视为交配成功,脱颈法处死雌鼠,取双侧输卵管,剪下末端膨大置于M2培养液中,在实体显微镜下撕开壶腹部,让卵细胞团自然流出,透明质酸酶除颗粒细胞,在M2培养液中洗三次,接受不同形式mRNA或shRNA注射,注射后在M16培养液中洗两次后转入12孔板,每孔加入200μl预先在培养箱中平衡的M16培养液,上覆矿物油,在37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养。3、mRNA表达载体的构建用限制性内切酶HindⅢand BamHI将质粒pBSK-PKB-WT上的cDNA亚克隆到表达载体pcDNA3.0（+）上,简称为pcDNA-PKB-WT。应用定点突变试剂盒将PKB的Ser473突变为丙氨酸,这个突变体称为pcDNA-PKB-S473A。所有重组载体均经测序鉴定基因插入正确及成功引入突变。4、体外转录各种重组体分别取1μg,经AgeⅠ酶切线性化,应用体外转录试剂盒将线性模板体外转录成带帽mRNA,然后用1μl DNaseⅠ于37℃反应15 min消化DNA模板,用酚、氯仿抽提纯化mRNA,最后应用氯化锂沉淀mRNA。5、mRNA显微注射显微注射应用Eppendorf Transferman显微操作系统,OlympusⅨ-70倒置显微镜,DIC调制相差观察。显微注射在M2液滴中进行。为尽量减少显微注射对受精卵的影响,一般注入到受精卵内的样品体积为10 pl（相当于其总体积的5%）。mRNA溶解于无核酸酶污染的5mmol/L Tris和0.5mmol/L EDTA（pH7.4）中,稀释成不同浓度;对照组为TE缓冲液组。6、shRNA胞核显微注射显微注射应用Eppendorf Transferman显微操作系统,OlympusⅨ-70倒置显微镜,DIC调制相差观察。将G1期受精卵移入到M2液滴中,用持卵针将受精卵固定,将吸好一定量无内毒素质粒pSUPER-GFP-raptor shRNA/rietor shRNA的注射针刺入细胞将样品注入胞核。为尽量减少显微注射对受精卵的影响,一般注入到受精卵内的样品体积为10 pl（相当于其总体积的5%）。对照组注射TE缓冲液组。Scytonemin处理小鼠受精卵来观察Plk1对卵细胞早期发育的影响。Scytonemin溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。我们使用酸性台式液去除G1期小鼠受精卵的透明带,并在24孔板中分别使用不同浓度的（0,1,2,3和4μM）Scytonemin来孵育受精卵。对照组的受精卵仅使用等量的二甲基亚砜孵育。在HCG注射后30-35小时,我们使用解剖显微镜来观察卵裂率,并使用相差显微镜观察此时受精卵的形态。7、RT—PCR检测1细胞期受精卵各细胞期中Plk1、raptor和rictor的mRNA水平100个各期受精卵收集到2ml微量离心管中,按QuickPrep micro mRNAPurification试剂盒说明书进行:主要包括:样品的提取,mRNA的分离,分别用高盐缓冲液和低盐缓冲液对已结合mRNA的oligo（dT）纤维颗粒的洗涤,mRNA的洗脱。用TaKaRa RNA PCR（AMV）Ver3.0试剂盒,按操作步骤进行反转录和PCR:Plk1的引物:5’-TGACGAGTTCTTCACTTCTGGCTA-3’和5’-ATTGCGGAAATAGTTGAGGAGAGT-3’,预计产物长度548bp;raptor的引物:5’-GGCGGACCTTAC AGATTGG-3’和5’-TTGGCTGCCAGTTCTCATAC-3’,预计产物长度230bp;rictor的引物:5’-CGAAGCATTTCCTGTCCC-3’和5’-ACGGCTCCTGGTGACTTG-3’,预计产物长度1347bp;PCR反应体系为25μl,反应条件是①94℃,3min;②94℃,30sec;③50℃,30s ec;④72℃,1min;⑤72℃,10min;②—④循环30周;以β—actin作为内对照,引物为:5’-TCCTATCGGCCTCCTCC TAC-3’和5’-AGAATGTAGTCCGCCAGGTC-3’,预计产物长度为337bp。反应产物经琼脂糖凝胶电泳后成像。8、Western印迹收集小鼠1细胞分裂各期的受精卵各200个,转移到1.5ml Eppendof管中,4℃3000rpm离心10min,尽量去除培养液,加入适量粉碎缓冲液（20mmol/L Tris-HCl,pH7.5,2mmol/L EDTA,10mmol/L EGTA,0.25mmol/L Glucose）,充分振荡混匀,然后经3～4次冻融循环,迫使卵细胞裂解,置于-20℃备用。电泳前,加入SDS样品缓冲液,100煮沸5min,离心后上样,10%SDS-PAGE电泳分离,然后将蛋白转至硝酸纤维素膜上,之后用含5%BSA的TBS（pH7.4）将滤膜于室温摇动温育1h进行封闭,封闭后的滤膜再与特异性的抗体4℃孵育过夜。经TTBS洗涤后,辣根过氧化物酶偶联的IgG作为二抗（稀释比为1:2000）室温温育2h,洗膜后,使用ECL发光法显色。9、激酶活性测定将收集的鼠卵冻融3次,使细胞裂解,分别加入Plk1反应液25μl。30℃水浴反应7 min,取25μl点Whatman P81强阳离子交换滤纸上,将滤纸置于含10 ml蒸馏水的液闪瓶内,用Beckman液闪计数仪测定cpm值。10、放射自显影检测mTOR活性将收集的鼠卵冻融3次,使细胞裂解,分别加入mTOR反应液45μl。30℃反应30分钟,后加入50μl 2XSDS上样缓冲液终止反应。取25μl反应后的样品进行SDS-PAGE电泳,电泳结束后把分离胶切下放在滤纸上,在分离胶的上面覆盖上保鲜膜,而后通过放射自显影的方法,通过底物蛋白4E-BP1带有的32p感光胶片,显影,漂洗,定影,冲洗,晾干。11、放射自显影检测PKB活性将收集的鼠卵冻融3次,使细胞裂解,分别加入PKB反应液45μl。30℃反应30分钟,后加入50μl 2XSDS上样缓冲液终止反应。取25μl反应后的样品进行SDS-PAGE电泳,电泳结束后把分离胶切下放在滤纸上,在分离胶的上面覆盖上保鲜膜,而后通过放射自显影的方法,通过底物蛋白H2B带有的32p感光胶片,显影,漂洗,定影,冲洗,晾干。实验结果1、小鼠受精卵第一次有丝分裂过程中Plk1的表达水平为了进一步检测Plk1在小鼠1细胞期各个期中的蛋白表达水平,我们使用特异的Plk1抗体。结果显示,无论在G1、S期,还是G2、M期,Plk1的蛋白表达都保持恒定。我们还使用特异的引物对小鼠受精卵的cDNA进行PCR,结果显示,与蛋白表达水平一致,Plk1在受精后四个期的mRNA水平无明显差异。2、P1k1在小鼠1细胞受精卵发育中活性变化为了确定是否Plk1在小鼠1细胞期受精卵早期发育中发挥重要作用,我们使用32p来检测Plk1在四个期中的活性。结果显示,Plk1的活性是随着细胞周期的进程而变化的,在G1和S期,其活性保持平稳,当进入G2期后Plk1的活性逐渐增高在M期达到最高峰。随后在进入分裂间期迅速下降。这个结果说明在小鼠受精卵的分裂过程中Plk1可能是在M期起到一定的作用。3、Scytonemin能够抑制1细胞期小鼠受精卵的G2/M转换我们使用Plk1特异性抑制剂scytonemin来检测Plk1在小鼠受精卵早期发育中的生物学功能。我们使用scytonemin来孵育小鼠1细胞期受精卵,并观察受精卵卵裂情况。二甲基亚砜作为溶解剂来溶解scytonemin（二甲基亚砜浓度＜0.5%）。当scytonemin孵育受精卵24小时后,我们检测在scytonemin不同浓度（0,1,2,3和4μM）对卵裂率的影响。结果显示,当使用2μM scytonemin时卵裂率明显被抑制（P＜0.005）。我们还观察到,当使用2μM scytonemin时受精卵会停滞在G2/M期;而那些无处理组的受精卵能够正常发展到2细胞期。这说明当Plk1被抑制后会影响小鼠1细胞期受精卵的G2/M转换。4、通过scytonemin和Plk1 shRNA抑制Plk1的活性能够提高CDC2Tyr15的磷酸化水平CDC2 Tyr15磷酸化后,会使MPF失活,结果导致1细胞期受精卵有丝分裂停滞。我们分别使用scytonemin和Plk1 shRNA来抑制Plk1的活性,来观察是否Plk1通过抑制CDC2 Tyr15的磷酸化来调节受精卵分裂的。我们使用CDC2 Tyr15磷酸化抗体来检测无处理组和被scytonemin或Plk1 shRNA处理的受精卵中CDC2Tyr15磷酸化水平。结果显示,无处理组的受精卵M期的CDC2 Tyr15有较高的磷酸化水平,但是在scytonemin或Plk1 shRNA处理组的受精卵发育到M期后CDC2 Tyr15的磷酸化水平比无处理组有明显的降低。这个结果间接证明了我们的设想,Plk1能够使CDC2 Tyr15磷酸化,从而激活MPF来调节1细胞期受精卵的有丝分裂进程。5、小鼠受精卵各期中raptor和rictor在mRNA水平的表达为了进一步检测Plk1在小鼠1细胞期各个期中的蛋白表达水平,我们使用特异的引物对小鼠受精卵的cDNA进行PCR,结果显示,raptor亚基在受精后四个期的mRNA水平无明显差异,而rictor亚基只在S期和G2期受精卵中有较高的表达水平,而G1期和M期的表达很低,对灰度值统计分析表明,差异具有显著性。6、显微注射pSUPER-GFP-raptor shRNA/rictor shRNA对受精卵发育的影响。取G1期受精卵分别显微注射pSUPER-GFP-raptor shRNA/rictor shRNA入胞核,M16中培养35小时后,使用荧光显微镜观察有两种质粒注射的受精卵中有绿色荧光蛋白表达,并且发现在raptor shRNA注射的受精卵可以正常进入2细胞期,而在rictor shRNA注射的受精卵不能正常进入2细胞期,停滞在G2期或发生异常分裂。1细胞期受精卵分别注射5pg raptor shRNA和rictor shRNA,在hCG后35小时观察统计卵裂情况。小鼠受精卵1细胞期对照组卵裂率在73.43%左右;raptor shRNA注射组的卵裂率为74.17%;而rictor shRNA注射组的卵裂率只为17.07%。与对照组相比,raptor shRNA注射组的卵裂率没有明显改变（P＞0.05）;而rictor shRNA注射组与对照组和raptor shRNA注射组相比卵裂率显著降低（P＜0.05）。7、mTOR和PKB在各期受精卵中的活性变化以4EBP1为底物,通过放射自显影测定不同发育阶段的1细胞期受精卵中的mTOR活性,实验结果显示在受精卵G1期mTOR有较高的活性状态,进入S期后mTOR的活性进一步升高达到细胞周期中最高水平,到G2期mTOR活性较S期有所降低,但仍保持着高活性状态,直到第一次有丝分裂M期,mTOR的活性急剧下降。同时,以H2B为底物,通过放射自显影测定不同发育阶段的1细胞期受精卵中的PKB活性,结果可见在受精卵G1期PKB处于较低的活性状态,进入S期后PKB的活性升高,到G2期PKB活性较S期进一步升高,达到细胞周期中最高水平,直到第一次有丝分裂M期,PKB的活性急剧下降。8、PKB-WT、PKB-S473A分别注射及它们与rictor shRNA共注射对小鼠1细胞期受精卵分裂率的影响1细胞期受精卵分别注射0.01ng编码PKB-WT及PKB-S473A的mRNA,在hCG后30-33小时观察统计卵裂情况。在小鼠1细胞期受精卵对照组（TE注射组）卵裂率在73.43%左右,PKB-WT注射组的卵裂率达到73.50%,同对照组之间没有显著差异（P＞0.05）;而PKB-S473注射组的卵裂率为16.93%,与对照组和PKB-WT注射组比,有明显的降低（P＜0.05）。为了进一步研究mTOR/rictor和PKB之间的关系,我们先注射0.005ngpSUPER-GFP-rictor shRNA质粒到胞核中,受精卵在M16培养基中培养1小时以后,再注射0.01ng PKB-WT或PKB-S473A的mRNA到胞浆中,在注射hCG后30-33小时观察统计卵裂情况。Rictor shRNA/PKB-WT注射组的卵裂率为21.60%,rictor shRNA/PKB-S473A注射组的卵裂率为15.90%,这两个共注射组与对照组和PKB-WT注射组相比,卵裂率明显下降（P＜0.05）,但与PKB-S473注射组相比,卵裂率没有明显不同（P＞0.05）;这两个共注射组之间相比,卵裂率没有显著差异（P＞0.05）（图8）。这些结果表明PKB-S473A能有效的抑制由mTOR引起的1细胞期受精卵的发育。9、PKB-WT、PKB-S473A分别注射及它们与rictor shRNA共注射对小鼠1细胞期受精卵中PKB活性的影响G1期受精卵分别注射0.01ng编码PKB-WT及PKB-S473A的mRNA,在hCG注射后27-30小时收集卵细胞,测PKB的活性。TE注射组PKB保持较高活性,PKB-WT注射组PKB活性与对照组（TE注射组）相比,PKB活性没有明显差异;PKB-S473A、rictor shRNA/PKB-WT和rictor shRNA/PKB S473A三个注射组PKB活性与对照组和PKB-WT注射组相比明显降低（P＜0.05）,但它们三组之间没有显著性差异（P＞0.05）（图9）,这个结果表明,mTOR/rictor是通过磷酸化PKB的473位丝氨酸来调节PKB活性,从而调控小鼠受精卵的早期发育。讨论Plk1在有丝分裂中是一个重要的调节因子,在细胞分裂中发挥重要的作用。在一些真核生物中,Plk1在参与细胞周期调控的重要环节,且与有丝分裂进程相关,包括G1/S转换中的中心体复制,纺锤体极的形成等。最近一些研究显示,Plk1的蛋白表达在有丝分裂中保持一个比较恒定的水平。这与我们对于Plk1表达水平的检测结果是相一致的,我们通过免疫印记和RT-PCR的方法检测了Plk1的蛋白和mRNA水平,结果显示它们在有丝分裂细胞周期中保持比较恒定的水平。但是,我们同时使用32p进行Plk1体外激酶活性实验,结果显示Plk1的激酶活性在G2/M转换的时候会升高,而在M期后期时会显著降低。这些结果可能表示Plk1在小鼠受精卵早期的G2/M转换中发挥重要作用。接下来,我们使用了Plk1的特异性抑制剂scytonemin。它是一个小分子的化合物,能够特异性的抑制Plk1的活性,而且它对Plk1的抑制作用的浓度依赖性的,半数抑制剂量为2μM。我们当使用了scytonemin作用受精卵24小时后,在倒置显微镜下观察受精卵,有80%的受精卵被阻滞在G2/M期,不能进入2细胞期。同时我们检测了CDC2的15位酪氨酸的磷酸化水平,发现在M期时磷酸化水平与未加抑制剂组相比有明显上升。这些数据与以前的一些研究相一致,Plk1对于受精卵G2/M期转换是非常重要的。为了进一步验证我们的观点,我们使用了Plk1的shRNA来沉默Plk1的表达。当我们把Plk1 shRNA质粒显微注射入G1期受精卵的胞浆中,它能够明显抑制Plk1的表达。同时Plk1 shRNA还能提高受精卵在M期时CDC215位酪氨酸的磷酸化水平,这与Plk1被scytonemin抑制后的结果是一致的。这更有力的证明了,Plk1通过使磷酸化CDC215位的酪氨酸去磷酸化来参与小鼠受精卵有丝分裂的调节。当前,受精卵早期发育机制的研究仍是学术界的热点问题。本实验就Plk1在小鼠受精卵早期发育中的作用,做了初步的探讨。我们认为Plk1是通过使磷酸化CDC215位酪氨酸去磷酸化来调节小鼠受精卵的有丝分裂的。而究竟Plk1是通过什么途径来使CDC215位酪氨酸去磷酸化的,是我们将来的研究方向。mTOR蛋白在细胞生长过程中是一个重要的调节因子。mTOR有两个复合物,包括mTOR-Raptor（称为mTORC1）和mTOR-Rictor（称为mTORC2）。mTORC1能够磷酸化P70S6K中389位苏氨酸,然而mTORC2能够磷酸化PKB473位丝氨酸。在最新的研究中发现,mTORC2对于激活PKB-FOXO和PKC信号通路是一个非常重要的作用因子。在前期实验中我们通过向小鼠1细胞期受精卵中注射rictor shRNA,观察到mTOR/rictor能够促进受精卵的发育,且当rictor被沉默后,PKB的活性也降低。在此基础上,我们应用生物信息学软件确定了小鼠PKB蛋白序列中mTOR/rictor的磷酸化靶位点——Ser473。我们向受精卵内共注射rictor shRNA和PKB-WTmRNA,发现rictor shRNA可以抑制PKB-WT对受精卵发育的促进作用,提示PKB很可能是mTOR/rictor的作用底物,参与了mTOR对小鼠1细胞期受精卵发育的调节过程。同时注射PKB-S473A突变体的1细胞期受精卵,发育几乎完全被抑制,卵裂率只有16.93%。这些结果表明mTOR/rictor可能通过PKB的473位丝氨酸的磷酸化影响小鼠1细胞期受精卵的发育,因而mTOR/rictor/PKB通路在受精卵早期发育中发挥重要作用,但此作用是直接还是间接,尚需体外实验的证实。本研究首次提出在小鼠受精卵早期发育过程中,mTOR/rictor通过作用于PKB的473位丝氨酸促进PKB的活化,进而促进1细胞期受精卵的发育,这一发现为阐明mTOR/rictor的具体作用机制提供了依据和新的线索。同时也应该看到以上的实验均为体内研究,要证明mTOR/rictor/对PKB的直接磷酸化作用仍需要体外激酶底物磷酸化反应的进一步验证,这些都是我们今后进一步研究的方向。结论1、在小鼠受精卵第一次有丝分裂过程中Plk1的含量没有变化。Plk1的活性是随着细胞周期的进程而变化的,在M期达到最高峰。2、Plk1能促进小鼠1细胞期受精卵的发育,其活化对于小鼠受精卵的发育是必需的。Plk1是通过使CDC215位酪氨酸去磷酸化调节小鼠受精卵的有丝分裂。3、mTOR的raptor亚基在小鼠1细胞期受精卵的四个期中均有表达且表达水平一致,rictor亚基在S/G2期有高表达而在G1和M期表达水平很低。Rictor亚基与mTOR结合能促进小鼠1细胞期受精卵的发育,对于小鼠受精卵的发育是必需的。4、在小鼠1细胞期受精卵中,mTOR/rictor可能作用底物为PKB,通过将PKB的473位丝氨酸磷酸化,影响PKB的激活,进而促进受精卵的早期发育。mTOR/rictor/PKB途径在小鼠受精卵早期发育中发挥重要作用。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一 1细胞期中Plk1的表达及活性检测
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 论文二 在小鼠1细胞期受精卵中Plk1通过磷酸化CDC2 Tyr15来调节MPF的活性
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 论文三 mTORC1和mTORC2在小鼠1细胞期受精卵中的表达及对1细胞期受精卵分裂的影响
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 论文四 小鼠受精卵早期发育过程中mTOR/rictor对PKB活性的影响
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介