子宫内膜异位症的蛋白质组学研究

论文摘要

子宫内膜异位症（简称内异症,Endometriosis,EMs）是指具有生物学活性的子宫内膜种植在子宫腔以外的组织中,主要临床症状表现为痛经、不孕、慢性盆腔痛及性交痛等,是育龄期妇女常见病、多发病之一。据报道其发病率高达3%-10%,且近年来有明显增高的趋势,其中30%-50%的内异症患者伴发不孕,30%-58%的不孕症患者合并内异症,因而内异症对患者的身心健康及生活质量有很大影响。此疾病虽是一种良性疾病,但却具有转移、种植等恶性行为。内异症的发病机理尚未研究清楚,但多项研究表明与正常妇女相比内异症患者血清、腹腔液中多种生化分子的表达均增高,如癌抗原CA-125、CA19-9、抗子宫内膜抗体以及某些细胞因子等,同时内异症患者的在位子宫内膜生化特性也发生了改变。目前子宫内膜异位症诊断的金标准是腹腔镜检查结合病理学诊断,但可以代替腹腔镜作为内异症诊断的简单、无创的金标准仍缺乏,临床有将上述表达变化的生物学分子用作辅助诊断手段,但它们的敏感性和特异性不高,而且诊断界值尚未确定,故仅具有临床参考价值。随着人类基因组学研究的逐渐完成,生命科学的探索已经进入了后基因组时代,即蛋白质组时代。蛋白质组学研究方法有很多种,与传统的研究手段相对,这些方法具有高通量、高效率、高准确性等特点,目前已经被广泛应用于多方面的研究。因此我们课题采用蛋白质组学的研究方法对内异症患者的血清以及在位子宫内膜组织的蛋白质表达变化进行研究,以寻找与内异症发生、发展相关的蛋白质,这将有助于内异症的诊断以及复发的预测。表面增强激光解析离子-飞行时间质谱（surface enhanced laserdesorption/ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS）技术由于能对不同的生物粗样品快速地建立蛋白质谱或肽谱,已被广泛地以用于多种疾病的研究。本研究应用SELDI-TOF-MS技术对子宫内膜异位症患者血清进行分析,比较其与对照组血清中蛋白质表达的差异,应用差异蛋白建立内异症患者血清诊断模型,旨在寻找血清中差异表达的蛋白质,探讨将他们作为内异症血清学诊断指标的可能性。本研究还应用了双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）技术联合基质辅助激光解析飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-MS/MS）分析技术,获得了内异症患者和对照妇女在位子宫内膜表达的差异蛋白,并对其进行质谱鉴定,有助于内异症发生发展机理的进一步研究。第一部分子宫内膜异位症血清生物标记物的筛选及诊断模型的建立目的:筛选子宫内膜异位症患者血清中与内异症发生、发展相关的生物标记物,建立内异症的血清诊断模型,同时进一步探讨内异症发生、发展的分子机制。方法:将所收集到的79例内异症患者和72例对照组妇女的血清,利用弱阳离子交换蛋白质芯片（WCX2）,经表面增强激光解吸离子-飞行时间-质谱（SELDI-TOF-MS）读取蛋白质谱,建立内异症血清蛋白质指纹图谱,按照月经周期将样品分为增生期组和分泌期组两组,通过Biomarker Wizard Software分别比较增生期组和分泌期组中内异症患者和对照组血清之间蛋白质表达的差异,通过Biomarker Patterns Software（BPS）利用差异蛋白分别建立内异症的诊断模型并对模型进行盲法验证。结果:（1）对56例内异症和57例对照血清不分期所建立的蛋白指纹图谱中,在M/Z 2000-30000范围内共检测到231个差异蛋白峰,其中16个蛋白质有统计学意义（p＜0.01）,内异症患者血清中上调的蛋白有11个,M/Z分别为3963.50、4172.09、4195.31、4304.10、4493.25、8121.06、8180.75、16947.30、17199.80、17823.80、18354.20,下调的有5个,M/Z分别为2014.83、2032.87、5637.32、6103.08、10255.60;利用这些血清差异蛋白质应用BPS建立了由M/Z4172.09、5637.32、1963.80的3个蛋白所组成的决策树诊断模型,其敏感性为80.0%（46/59）,特异性为80.7%（46/57）,总准确率为79.3%（92/116）;盲法验证结果显示模型的敏感性为73.4%（58/79）,特异性为72.2%（52/72）,阳性预测值为74.4%（58/78）,阴性预测值为71.2%（52/73）。（2）分泌期组内异症和对照组血清相比共检测到147个差异蛋白质,其中6个有统计学意义,内异症患者表达上调的有2个,M/Z分别为8170.70、18332.80,表达下调的蛋白质有4个,M/Z分别为5631.90、5894.80、6096.70、10224.10;应用5个差异蛋白建立的决策树诊断模型敏感性为96.7%（29/30）,特异性为100%（23/23）,总准确率为98.1%（52/53）;盲法验证的结果显示敏感性为100%（36/36）,特异性为34.5%（10/29）,阳性预测值为65.5%（36/55）,阴性预测值为100%（10/10）。（3）增生期两组间有196个表达差异蛋白质,3个有统计学意义,内异症组表达上调的有2个蛋白,M/Z分别为15819.7、16046.3,表达下调的为1个蛋白质,M/Z为3299.2。应用6个蛋白建立的诊断模型敏感性为94.3%（33/35）,特异性为97.1%（34/35）,总准确率为95.7%（67/70）。盲法验证结果显示模型的敏感性为90.7%（39/43）,特异性为93.0%（40/43）,阳性预测值为92.9%（39/42）,阴性预测值为90.9%（40/44）。结论:蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术重复性、稳定性较好,是比较理想的蛋白质组学研究技术平台之一;比较不同组别内筛选到的差异蛋白和所建模型可见月经周期影响内异症患者血清差异蛋白的筛选和模型诊断的准确性,因此对内异症差异蛋白的研究应该考虑月经周期的影响,而诊断内异症要在适当的月经周期。增生期组所建立的诊断模型敏感性和特异性较高,此模型在内异症诊断方面有重要的临床意义。第二部分子宫内膜异位症在位内膜蛋白质组学的研究目的:分别分析、筛选增生期和分泌期子宫内膜异位症患者与对照组在位子宫内膜的差异蛋白及其表达情况。方法:提取内异症患者和对照妇女在位子宫内膜的总蛋白,利用双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）技术进行分离,ImageScanner扫描仪扫描凝胶,Image Master 2D Platinum Software对图像进行分析、筛选差异蛋白,应用基质辅助激光解吸离子飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-MS/MS）鉴定蛋白质、数据库搜索鉴定出的蛋白质并对其进行生物信息学分析,同时应用WesternBlot技术对双向电泳结果进行验证。结果:对所提取的总蛋白进行2-DE分离、染色、脱色、扫描后,经优化条件后用ImageMaster软件分析,结果显示在增生期内异症组和对照组分别探测到1278±88（n=3）、1073±97（n=3）个蛋白点,选择点数较多的凝胶作为参考胶,两组之间可以匹配到756个点,匹配率为70.4%。其中蛋白含量差异≥2倍的蛋白点有89个,内异症组表达升高的有45个,表达下调的有44个。选取其中30个差异蛋白点进行MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定,去冗后共鉴定出20种不同的蛋白质,其中包括细胞骨架蛋白、钙结合蛋白、脂代谢相关蛋白等在内异症患者的在位内膜中表达上调;代谢相关酶、抗氧化蛋白、转录调控相关蛋白等表达下调;分泌期内对照组三块胶探测到的平均蛋白点为1052±109（n=3）个点,内异症组检测到1044±78（n=3）个点。组间匹配后得到847点,匹配率为81.1%。筛选蛋白含量差异≥2倍的点为有统计学意义的点共64个,其中内异症患者表达上调的有32点,下调的有32点。选取30个差异蛋白点进行质谱鉴定,结果鉴定出20种不同的蛋白质,其中与ATP生成有关的代谢酶、细胞骨架蛋白等在分泌期的内异症患者子宫内膜中表达上调,而与转录相关的核不均一蛋白K、H、C、抗氧化蛋白的表达均下调。结论:双向电泳技术结合质谱鉴定是一种相对稳定、高通量的蛋白质检测、筛选平台,可以用于大量样品的疾病蛋白质组学中蛋白质表达的研究,对发现与疾病发生、发展相关的蛋白质有重要的价值。结果表明子宫内膜异位症患者与非内异症者的在位内膜蛋白表达谱发生变化,其中包括细胞骨架蛋白、钙结合蛋白、脂代谢相关蛋白、代谢相关酶、抗氧化蛋白、转录调控相关蛋白等,其中的一些特异性蛋白质有可能在子宫内膜异位症发生发展过程中起关键作用。

论文目录

• 中英文缩略表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 子宫内膜异位症血清生物标记物的筛选和诊断模型的建立
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 子宫内膜异位症在位内膜蛋白质组学的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 文献综述
• 附录
• 致谢