小牛凝乳酶基因在大肠杆菌中可溶性表达研究

论文摘要

凝乳酶（Chymosin,CYM）是干酪生产中的关键酶,传统的凝乳酶来源是没有断奶的小牛皱胃,但是随着世界奶酪产业不断发展壮大,每年宰杀上千万头犊牛以获得凝乳酶的方法显然是与现代工业发展极不协调的。为解决这一突出矛盾,80年代以来,美、日、英、苏等国相继开展了凝乳酶基因工程研究。由于重组凝乳酶在理化性质和生物学活性接近于天然蛋白质,且可以通过大规模制备源源不断地获得,目前已被广泛的应用于干酪的生产。在研究和生产中,大多数情况下我们都希望能够获得大量的可溶性重组蛋白。但是,大肠杆菌表达系统通常会产生不溶的无活性的蛋白聚集,即包涵体（Inclusion Bodies,IB）,这是该系统应用的巨大障碍。随着对大肠杆菌中蛋白质折叠机制的深入研究,目前己经找到了一些提高重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法:其中,低温诱导和融合表达策略是最有效的方法。本文以含有小牛凝乳酶cDNA的pUC18-CYM质粒为模板,通过rKOD DNA聚合酶反应体系对CYM基因进行PCR扩增,上游增加了Hind III酶切位点、下游增加了Xba I酶切位点。扩增产物克隆至pUC57克隆载体,利用两种不同的可提高可溶性表达的载体,即冷启动表达载体（pCold）和低温融合表达载体（pCold-SUMO）构建pCold-CYM与pCold-SUMO-CYM原核表达系统,并选择先进的突变体菌株（Arctic和Origami）作为宿主菌对CYM基因进行原核表达。同时,研究了表达温度、融合标签、诱导条件等因素对蛋白表达量和表达形式的影响。可溶性分析结果表明,通过低温诱导可明显地放慢细胞内蛋白表达速率,减少二硫键错误折叠几率;融合标签的选择可极大地影响蛋白的表达量和可溶率,并可以在此基础上通过表达条件的优化使蛋白取得良好的可溶效果。此外,正确选择突变体菌株也可以有效地帮助蛋白减少二硫键的错配几率,促进其正确折叠从而增加蛋白可溶性。我们通过研究牛凝乳酶蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达方案,对各种影响可溶性几率的条件进行了分析和优化,并根据本研究结果初步建立了一套设计和探寻牛凝乳酶蛋白可溶性表达的策略。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.1.1 前言
• 1.1.2 凝乳酶的来源与种类
• 1.1.3 牛凝乳酶的化学性质与结构
• 1.2 凝乳酶发展概况
• 1.3 重组凝乳酶发展概况
• 1.3.1 重组凝乳酶的原核表达
• 1.3.2 重组凝乳酶的真核表达
• 1.3.3 重组凝乳酶的生产和应用
• 1.4 重组凝乳酶存在的问题
• 1.5 重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达
• 1.5.1 大肠杆菌表达系统
• 1.5.2 包涵体形成的原因
• 1.5.3 提高蛋白可溶性表达的方法
• 1.6 课题来源及研究意义
• 1.7 研究主要内容
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 药品和试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 溶液
• 2.1.5 仪器和设备
• 2.1.6 主要分子生物学软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2 含目的基因重组质粒的提取
• 2.2.3 目的基因的扩增
• 2.2.4 扩增产物的纯化/回收
• 2.2.5 目的基因的克隆
• 2.2.6 目的基因的转化
• 2.2.7 目的基因的表达
• 第3章 重组表达载体的构建
• 3.1 基因扩增
• 3.2 载体构建
• 3.2.1 克隆载体的构建
• 3.2.2 表达载体的构建
• 3.3 本章小结
• 第4章 基因的表达
• 4.1 表达结果分析
• 4.1.1 初步检测
• 4.1.2 IPTG 浓度优化
• 4.1.3 可溶性分析
• 4.2 诱导条件对蛋白可溶性表达的影响
• 4.3 表达载体对蛋白可溶性表达的影响
• 4.3.1 培养温度对表达的影响
• 4.3.2 融合标签对表达的影响
• 4.4 宿主菌对蛋白可溶性表达的影响
• 4.5 凝乳酶活性检测
• 4.6 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录1 CYM 基因密码子及对应蛋白序列
• 附录2 CYM 基因测序结果
• 致谢