胸膜间皮细胞上皮钠通道的表达及调控

论文摘要

前言间皮细胞是一种分布在浆膜腔的特殊类型上皮细胞,被覆于胸膜腔,心包腔,腹膜腔以及内脏器官表面。直到最近的二十年人们才注意到间皮细胞在维持浆膜腔完整性及功能方面发挥重要作用。胸腔积液是临床常见疾病,由于胸膜腔内液体的分泌和重吸收之间的平衡紊乱所致。越来越多的证据表明间皮细胞能主动转运水和电解质,继而调节体腔内的液体总量。上皮钠通道（ENaC）是钠离子通过极化上皮细胞顶侧膜的主要通路,目前已被克隆和进行特征研究。至今已克隆出五种ENaC亚单位,分别命名为α-,β-,γ-,δ-和ε-ENaC。ENaC通道依其组成亚单位的不同,表现的生物物理学特性也不尽相同。当利尿剂阿米洛利加入顶膜侧的浴液内时,10-6M的浓度即能抑制Na+的转运。间接证据表明在人类和绵羊壁层腹膜存在阿米洛利敏感性钠通道。应用阿米洛利后跨间皮的电阻增加,表明可能存在阿米洛利敏感性离子转运途径,其可能参与腹膜透析期间的超滤过程和钠的清除。通过对比上皮细胞的极化状态,可以推测ENaC通道蛋白表达在腹膜腔的浆膜侧。已有证据表明存在于肺上皮细胞中的ENaC在肺泡液体清除率方面发挥重要作用,而有关间皮组织中的胸膜腔液体清除的机制目前尚不清楚。我们推测在人间皮细胞中有ENaC的表达,并成为阿米洛利敏感性跨间皮电阻的分子学基础。在本研究中,我们检测了ENaC在人和小鼠间皮细胞中的表达。我们的研究结果首次表明了ENaC通道在人胸膜间皮细胞中有生化方面及功能性的表达,并能被细胞cAMP和cGMP上调。可以由此推测ENaC在调控胸膜腔液体转运方面发挥重要作用,并参与胸腔积液的病理生理过程。方法细胞培养-NCI-H441细胞购自American Type Culture Collection（ATCC）。人胸膜间皮瘤M9K细胞系和人原代胸膜间皮细胞由Dr.Steven Idell提供（美国德州大学健康科学中心）。人胸膜间皮细胞提取于患有充血性心力衰竭病人的胸腔积液。H441和人原代胸膜间皮细胞用添加10%胎牛血清和抗生素的RPMI培养液（ATCC）进行培养,M9K细胞则生长于Medium 199（Invitrogen）中。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）-将长满的M9K及人原代胸膜间皮细胞刮于冷的PBS液中,离心后置于-80℃保存。BALB/c雄性小鼠（Jackson Laboratory）充分麻醉后手术分离小鼠壁层胸膜组织。用TRIzol试剂盒（Invitrogen）根据使用手册提取总RNA。采用一步法RT-PCR试剂盒（Qiagen）在梯度热循环仪（EppendorfScientific）中进行RT-PCR反应。PCR产物用DNA序列分析证实（DNA SequencingCore,UAB）。Western blot-应用6%凝胶进行SDS-PAGE分离后,将蛋白转染于PVDF膜上（Bio-Rad）。在含20mM Tris-Cl pH 7.5,0.5M NaCl,5%无脂肪冻干奶粉溶液中孵育1小时后,加入一抗,4℃过夜。二抗室温孵育30分钟。应用ECL试剂盒（Amersham）分析图像,所用ENaC亚单位抗体的稀释浓度为1:5000。免疫荧光和共聚焦显微镜检查-种于滤膜或玻片的细胞用3%福尔马林（EMSciences）固定45分钟,继以0.5%Triton X-100孵育3分钟。用α-,β-,γ-和δ-ENaC的多克隆抗体20μg/mL常温下孵育细胞2小时,然后用Alexa Fluor 488羊抗兔IgG（H+L）10μg/mL（Invitrogen）常温孵育细胞2小时,采用300 nM DAPI（Invitrogen）进行核染5分钟。应用连有Olympus S97809相机的Olympus BX 50荧光显微镜获取图像。用共聚焦显微镜采集侧视图像。在Adobe PhotoShop CS3 extended中进行融合图像分析。尤斯灌流室-切除的胸膜组织置于尤斯灌流室（Physiologic Instruments）之前保存在生理盐溶液中。跨间皮短路电流由充以3 M KCl,4%琼脂糖盐桥的Ag-AgCl电极进行测定。用VCC-MC8电压钳放大器（Physiologic Instruments）测定短路电流,用Acquire and Analyse软件进行数据分析（version 2.3,PhysiologicInstruments）。爪蟾卵母细胞表达及双电极电压钳记录-成年雌性非洲爪蟾（XenopusExpress）充分麻醉后手术取出蛙卵,按1α:1β:1γ:1δ比例细胞内注射以50 nl无RNase水溶解的hENaC cRNAs 25 ng,注射cRNA 48小时后应用双电极电压钳技术记录全细胞电流。应用TEV-200电压钳放大器（Dagan）进行爪蟾卵母细胞电压钳制和记录电流,采用pCLAMP 10.0软件（Molecular Devices）进行采样和数据分析。膜片钳技术-将载有M9K细胞的玻片从培养皿中移出,放在置于倒置荧光显微镜（Leica DM IRB）的浴槽内。应用Axopatch 200B放大器（Molecular Devices）进行系列阻抗和电容补偿。记录全细胞电流时保持电位-40mV,应用-100至+100mV,步阶10 mV的电位进行电流电压曲线分析。单通道电流记录采用细胞贴附模式。采样频率为1-2 kHz,滤波频率为0.3 kHz。数据分析-所有数据结果采用均值±标准误表示。采用单尾分析法应用Origin8.0软件对实验结果进行分析,P＜0.05被认为统计学差异显著。结果RT-PCR结果显示四种（α,β,γ和两种δ）ENaC亚单位在人原代胸膜间皮细胞,人间皮瘤细胞系（M9K）,和小鼠胸膜组织中有表达。另外,Western blot和免疫荧光检查结果证实了α,β,γ和δENaC亚单位在人原代胸膜间皮细胞和M9K细胞中的蛋白水平表达。通过尤斯灌流室装置在M9K单层细胞和小鼠胸膜组织中记录到了一种能被阿米洛利抑制的短路电流。全细胞膜片钳记录结果显示在M9K细胞中的ENaC样通道,阿米洛利的IC50值为21μM。这种阳离子通道对细胞外Na+有很高的亲和力（Km值为53mM）,其离子选择性与ENaC相同,均为Li+＞Na+＞K+。Li+的单通道电导值为15 pS。四种ENaC亚单位在爪蟾卵母细胞中共同表达时能形成一种功能性的Na+通道。另外,我们发现在小鼠胸膜组织中forskolin和细胞膜通透性的cGMP均能增加短路电流。结论研究结果证实了在M9K细胞,一种人胸膜间皮瘤细胞系,和小鼠胸膜组织中α-,β-,γ-,和δ-ENaC亚单位的mRNA及蛋白水平表达。利用尤斯灌流系统我们在小鼠胸膜组织和M9K单层上皮细胞中记录到了一个阿米洛利敏感的,类似ENaC的短路电流。另外,利用全细胞和单通道膜片钳技术我们对这种阿米洛利敏感的,高Na+通透性的通道进行了特征性的研究。这些研究结果清楚的表明,由四个亚单位组成的ENaC通道,在胸膜间皮细胞中有生化学和功能性的表达,并能被细胞cAMP和cGMP上调。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 论文二
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 论文三
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介