香烟烟雾和氡吸入染毒致大鼠支气管肺组织蛋白质组表达的改变

论文摘要

目的：从蛋白质组学角度研究香烟烟雾和氡吸入染毒对大鼠支气管和肺损伤的早期生物学效应。寻找香烟烟雾和氡暴露所致蛋白质组的变化，为吸烟和氡暴露危害的早期诊断提供基础资料。方法：（1）建立双向电泳技术，比较大鼠肺组织总蛋白经不同长度和pH值IPG胶条分离后2-DE图谱的效果。（2）采用动式气体染毒装置对Wistar大鼠进行香烟烟雾染毒，装置内烟雾浓度控制在（20±5）％，氧气浓度控制在25％，每天染毒2次，每次30min，分别染毒1、2、4个月作为低、中、高剂量组。染毒后分别提取大鼠气管-支气管上皮细胞和肺组织的总蛋白，进行双向电泳分析。细胞总蛋白进行2-DE分离，硝酸银染色，寻找差异表达点；肺组织总蛋白进行2-DE分离，考马斯亮蓝染色，差异表达点进行MALDI-TOF或MALDI-TOF-TOF质谱分析，NCBInr数据库搜索鉴定分析结果。（3）多功能生态氡室对Wistar大鼠进行氡及其子体染毒，通过计算机控制装置内氡浓度使其剂量率恒定，保持在100000Bq／KL，每天染毒16h。氡及其子体累积染毒剂量分别达100、200、400WLM作为低、中、高剂量组，染毒后提取大鼠肺组织总蛋白进行2-DE分离，考马斯亮蓝染色，差异表达点进行MALDI-TOF或MALDI-TOF-TOF质谱分析，NCBInr数据库搜索鉴定分析结果。（4）对质谱鉴定出的差异表达蛋白质晚期糖基化终产物受体（RAGE）和硫氧还蛋白（TRX）进行Western blot分析，以GAPDH为内参，分析RAGE和TRX在上述各组染毒大鼠肺组织中的表达量，以Bandscan4.3分析软件进行灰度分析，数据结果以t检验进行统计分析。结果：（1）建立了肺组织总蛋白的双向电泳分离技术。银染法中，pH3～10，11cm的胶条分离到约450个蛋白质点，pH3～10，24cm的胶条分离到约625个蛋白质点，pH4～7，24cm的胶条分离到约1248个蛋白质点。在pH3～10的图谱上中间一部分蛋白点重叠，分离效果不太好，但在pH4～7的图谱中蛋白点分离效果较好，提示肺组织蛋白中中性pH范围的蛋白较多，确定肺组织蛋白双向电泳采用pH4～7，24cm的胶条进行2-DE分离。对大鼠肺组织蛋白进行的3次pH4～7，24cm胶条的双向电泳实验中，获得了分离效果和重复性较好的2-DE图谱。（2）建立了香烟烟雾染毒大鼠模型。病理切片结果显示各组大鼠肺气肿症状和支气管炎症反应逐渐加重，高剂量组胶原纤维明显增多。气管-支气管上皮细胞双向电泳银染法共发现23个差异表达蛋白点，其中11个点剂量-效应关系明显。肺组织总蛋白经2-DE分离、质谱分析，共鉴定出18种差异蛋白，包括10个上调的蛋白（β-肌动蛋白、2型角蛋白、晚期糖基化终产物受体（RAGE）、丙酮酸脱氢酶（PDH）、硫氧还蛋白（TRX）、ATP合酶、过氧化还原蛋白（PRX6）、dnaK分子伴侣蛋白（HSP70）、膜突蛋白、膜联蛋白Ⅲ），8个下调的蛋白质（原肌球蛋白4（TM4）、肌球蛋白轻链多肽（MLP4）、丝氨酸蛋白酶抑制剂B11（SERPIN B11）、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1（DDAH1）等）。（3）建立了氡及其子体染毒大鼠模型。病理切片显示各组大鼠病理变化主要为肺间质充血水肿、间隔增厚、炎症细胞浸润、胶原纤维逐渐增多，出现不同程度的肺气肿。肺组织总蛋白经2-DE分离、质谱分析，共鉴定出15种差异蛋白，包括9个染氡后上调的蛋白（锌指蛋白4、a-烯醇酶、微管蛋白β、HSP27、β-肌动蛋白、硫氧还蛋白（TRX）、RAGE、S100A6、膜联蛋白A2），6个染氡后下调的蛋白质（细胞色素C氧化酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、γ-肌动蛋白、醛脱氢酶（ALDH）、肌球蛋白轻链多肽4（MLP4）、LOC500450等）。（4）Western blot分析结果提示RAGE和TRX在香烟烟雾染毒及氡染毒各组大鼠肺组织中均有较好的剂量-反应关系，与2-DE结果一致。结论：建立了大鼠肺组织总蛋白的双向电泳技术，在此基础上测定了香烟烟雾和氡吸入染毒后大鼠支气管肺组织的蛋白质组表达。表达相同的蛋白有RAGE、TRX、Serpin、Annexin等，香烟烟雾染毒差异表达的蛋白包括2型角蛋白、过氧化还原蛋白6、HSP70和DDAH1等，氡差异表达的蛋白包括锌指蛋白4、HSP27、S100A6和细胞色素C氧化酶等。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 一、引言
• 二、正文
• 第一部分:大鼠肺组织双向电泳技术的建立
• 1 实验材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分:香烟烟雾染毒致大鼠支气管肺蛋白质组表达的改变
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分:氡及其子体染毒致大鼠肺组织蛋白质组表达的改变
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四部分:部分差异蛋白的免疫印迹分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 三、结论
• 四、参考文献
• 五、综述
• 六、研究生期间发表的文章
• 七、中英文缩略语对照表
• 八、致谢
• 详细摘要