羊传染性脓疱病毒F1L基因克隆、序列分析及核酸探针的研究

论文摘要

本试验将羊传染性脓疱病毒（CEV）内蒙古分离株（OV-nm-05）经犊牛睾丸细胞增殖培养,提取总DNA。参考GeneBank中Orf Virus（Strain NZ2）株F1L基因序列设计一对测序引物、一对诊断引物,应用PCR技术特异性地扩增出该毒株的F1L基因的片段,并将其克隆到pGEM-Teasy载体后进行测序,得到该病毒F1L基因序列。测序结果表明所扩增的DNA片段长1005bp个核苷酸,包含了完整的F1L基因的和基因两端的非编码区。应用计算机软件将测定序列与参考毒株OV-7、Strain NZ2、OV-C2、OV-mi-90、OV-Torino、OV-20的F1L基因序列进行比较。结果表明羊传染性脓疱病毒内蒙分离株与OV-mi-90同原性最高,达99.1%,与OV-Torino最低,但也为96.3%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙分离株F1L基因与其他参考毒株之间差异不大。用地高辛标记F1L基因片段,制备成核酸探针,采用斑点杂交法进行特异性和敏感性试验。结果显示,这种探针具有高度的特异性和敏感性,只与羊传染性脓疱病毒呈现阳性反应,与其他病毒的核酸呈现阴性反应,而且这种探针能够检测到20pg的OV-nm-05的DNA。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 羊传染性脓疱的概述
• 1.2 病原学
• 1.2.1 结构特征
• 1.2.2 生物学特性
• 1.2.2.1 培养
• 1.2.2.2 抗原性
• 1.3 流行病学
• 1.3.1 传染源和传播途径
• 1.3.2 易感动物
• 1.3.3 流行特征
• 1.4 发病机理
• 1.5 临床症状
• 1.5.1 唇型
• 1.5.2 蹄型
• 1.5.3 外阴型
• 1.6 病理变化
• 1.7 CE 的诊断
• 1.7.1 病毒分离鉴定
• 1.7.2 血清学诊断
• 1.7.3 分子生物学诊断
• 1.7.3.1 核酸探针诊断技术
• 1.7.3.2 PCR 诊断技术
• 1.8 CE 的免疫与防治
• 1.8.1 羊传染性脓疱免疫
• 1.8.2 羊传染性脓疱预防
• 1.8.3 羊传染性脓疱治疗
• 1.9 疫苗
• 1.10 本论文研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验毒株
• 2.1.2 参考毒株序列
• 2.1.3 犊牛睾丸细胞
• 2.1.4 酶和生物试剂
• 2.1.5 培养基和抗生素
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.1.7 引物的设计与合成
• 2.2 方法
• 2.2.1 病毒的增殖
• 2.2.2 总 DNA 的提取
• 2.2.3 羊传染性脓疱内蒙分离株基因克隆与序列分析
• 2.2.4 OV-nm-05 株 F1L 基因核酸探针的制备及斑点杂交
• 3 试验结果
• 3.1 目的基因的 PCR 扩增
• 3.2 重组pGEM-T/F1L 质粒的 PCR 鉴定结果
• 3.3 重组质粒测序结果
• 3.4 OV-nm-05 株 F1L 基因序列比较分结果
• 3.5 OV-nm-05 分离株 F1L 基因核酸探针的斑点杂交结果
• 3.5.1 核酸探针的特异性试验结果
• 3.5.2 核酸探针的敏感性试验结果
• 4 讨论
• 4.1 羊传染性脓疱诊断
• 4.2 PCR 方法
• 4.3 CEV 的 F1L 基因的序列分析
• 4.4 核酸探针技术的特异性和敏感性
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介