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传染性支气管炎病毒核蛋白粘膜免疫及ELISA检测方法的研究

2020-12-01阅读(465)

传染性支气管炎病毒核蛋白粘膜免疫及ELISA检测方法的研究

论文摘要

传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitis virus,IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBV的N蛋白在进化上较为保守,主要与基因组核酸的包裹、RNA的合成和细胞免疫有关,含有大量抗原决定簇,免疫原性仅次于S蛋白,能诱导机体产生交叉保护性抗体。本研究克隆表达了具有高度保守性的N蛋白基因,并将其作为免疫原制备多克隆抗体,建立检测IBV抗原的夹心ELISA法,为该病的早期诊断和控制提供了良好工具。IBV血清型较多,新的变异株在不断出现,且不同型毒株间缺乏交叉保护或仅有部分交叉保护,给免疫防治带来很大困难。本研究尝试利用霍乱毒素B亚基（Cholera toxin B subunit,CTB）的粘膜佐剂作用,将IBV N基因的表达产物与CTB混合或将N基因与CTB融合表达后,鼻腔免疫7日龄肉鸡,以期提高鸡鼻腔、气管和肠粘膜表面抗IBV sIgA的抗体水平,从而达到预防和控制IB的目的。本研究主要研究内容和研究结果如下:1.IBV核蛋白基因（np）与霍乱毒素B亚基基因（ctb）的融合表达将ctb基因和np基因融合后,在大肠杆菌BL21（DE3）中获得了成功表达,产物命名为rCTB-NP。复性后的表达产物经SDS-PAGE检测,出现了分子量大小为72.0kDa和92.0kDa的两条带。Western blot分析表明,融合蛋白rCTB-NP中的N蛋白具有良好的免疫反应性。GM1-ELISA实验结果表明,融合蛋白rCTB-NP中的CTB蛋白具有良好的免疫学活性。2.传染性支气管炎病毒重组核蛋白粘膜免疫效果研究将融合蛋白rCTB-NP,rNP、rNP+rCTB分别免疫7日龄肉鸡,用ELISA法检测血清中的IgG-NP、IgA-NP及鼻、气管和肠粘膜部位的sIgA-NP。结果发现,二免和三免后,血清中均能产生较高水平的IgG-NP抗体,但IgA-NP抗体水平较低;鼻、气管和肠粘膜部位rCTB+rNP组和rCTB-NP组的sIgA-NP抗体水平与NP组比较,前两组显著高于NP组（p＜0.05）;气管粘膜部位sIgA-NP水平表现为rCTB-NP组＞rCTB+rNP组＞rNP组。结果表明,CTB与IBV N蛋白融合表达产物或与该蛋白混合进行鼻腔免疫时,能显著提高鸡鼻腔、气管和肠粘膜表面sIgA的抗体水平。3.检测传染性支气管炎病毒的夹心ELISA方法的建立以鸡抗NP IgG为包被抗体,兔抗IBV IgG为二抗,建立了检测IBV的夹心ELISA法。结果表明,鸡抗IBV IgG的最佳包被浓度为2.5μg/mL,兔抗IBV IgG的最适工作浓度为5μg/mL;该方法比血球凝集试验敏感性高8倍以上,与NDV、AIV、EDS-76V、IBDV等无交叉反应,说明该法特异性和敏感性较高。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表
  • 第一章 文献综述
  • 1 禽传染性支气管炎研究进展
  • 1.1 IBV的病原学
  • 1.1.1 IBV的分类地位
  • 1.1.2 IBV的理化特性
  • 1.1.3 生物学特性
  • 1.1.3.1 血凝性
  • 1.1.3.2 对新城疫病毒复制的干扰性
  • 1.1.3.3 血清型
  • 1.2 鸡传染性支气管炎流行病学、临床症状和病理学特征
  • 1.2.1 流行病学
  • 1.2.2 临床病变类型
  • 1.2.2.1 呼吸型
  • 1.2.2.2 生殖道型
  • 1.2.2.3 肾型
  • 1.2.2.4 肠型
  • 1.2.2.5 腺胃型
  • 1.2.2.6 肌肉型
  • 1.3 传染性支气管炎的检测方法
  • 1.3.1 IBV的分离鉴定
  • 1.3.2 血清学诊断
  • 1.3.2.1 沉淀反应
  • 1.3.2.2 血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）
  • 1.3.2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）
  • 1.3.2.4 中和试验（VN）
  • 1.3.2.5 荧光抗体技术（FA）
  • 1.3.2.6 斑点免疫金测定法（DIGFA）
  • 1.3.3 分子生物学检测技术
  • 1.3.3.1 逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）
  • 1.3.3.2 核酸探针技术
  • 1.3.3.3 限制性片段长度多态性分析（RFLP）
  • 1.3.3.4 寡核苷酸指纹图谱分析
  • 1.4 传染性支气管炎疫苗的研究进展
  • 1.4.1 活疫苗
  • 1.4.2 灭活疫苗
  • 1.4.3 基因工程疫苗
  • 1.4.3.1 IB亚单位疫苗
  • 1.4.3.2 IB核酸疫苗
  • 1.4.3.3 IB重组疫苗
  • 1.4.3.4 IB转基因植物疫苗
  • 1.5 IBV的分子生物学
  • 1.5.1 IBV的基因组结构
  • 1.5.2 IBV的转录机制
  • 1.5.3 IBV的结构蛋白及其生物学功能
  • 1.5.3.1 纤突蛋白的结构与功能
  • 1.5.3.2 膜蛋白的结构和功能
  • 1.5.3.3 核蛋白的结构和功能
  • 1.5.3.4 E蛋白
  • 1.5.3.5 非结构域
  • 1.5.4 IBV的复制
  • 1.5.5 IBV的变异
  • 1.5.5.1 IBV遗传变异的研究状况
  • 1.5.5.2 IBV遗传变异的机理
  • 2 粘膜免疫研究进展
  • 2.1 家禽粘膜免疫研究进展
  • 2.1.1 家禽粘膜系统
  • 2.1.1.1 家禽粘膜系统的组成
  • 2.1.1.2 家禽粘膜免疫系统的特点
  • 2.1.1.3 家禽粘膜免疫系统的功能
  • 2.1.2 家禽粘膜免疫反应
  • 2.1.3 家禽粘膜免疫在抗感染中的作用
  • 2.1.3.1 家禽粘膜免疫抗感染机制
  • 2.1.3.2 家禽粘膜免疫抗感染作用
  • 2.1.4 家禽粘膜免疫系统与sIgA
  • 2.1.4.1 sIgA是粘膜免疫系统的主要体液防御因子
  • 2.1.4.2 sIgA在粘膜免疫应答中的作用
  • 2.1.5 疫苗与粘膜免疫的关系
  • 2.1.6 早期粘膜免疫对免疫器官的激活和启动作用
  • 2.1.7 母源抗体与粘膜免疫
  • 2.2 经鼻免疫及其佐剂的研究进展
  • 2.2.1 鼻内免疫
  • 2.2.2 鼻粘膜免疫相关佐剂
  • 2.2.3 霍乱毒素B亚单位研究进展
  • 2.2.4 CTB粘膜佐剂的展望
  • 第二章 传染性支气管炎病毒核蛋白基因和霍乱毒素B亚基的融合表达
  • 1 研究目的与意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 试验材料
  • 2.1.1 质粒及菌株
  • 2.1.2 酶及主要试剂
  • 2.1.3 血清
  • 2.2 主要溶液的配制
  • 2.2.1 抗生素类
  • 2.2.2 细菌培养基
  • 2.2.3 质粒抽提相关溶液
  • 2.2.4 SDS-PAGE相关溶液
  • 2.2.5 Western blot相关溶液
  • 2.2.6 表达提取纯化表达蛋白的相关溶液
  • 2.2.7 其它试剂
  • 2.3 方法
  • 2.3.1 引物设计
  • 2.3.2 PCR反应体系
  • 2.3.3 PCR产物的电泳检测
  • 2.3.4 PCR产物的回收与纯化
  • 2.3.5 PCR产物的克隆
  • 2.3.6 大肠杆菌DH5α、BL21感受态的制备（氯化钙法）
  • 2.3.7 质粒的转化
  • 2.3.8 质粒的小量制备（碱裂解法）
  • 2.3.9 序列测定
  • 2.3.10 DNA重组技术（DNA酶切、连接）
  • 2.3.11 重组质粒的酶切鉴定
  • 2.3.12 原核表达载体的构建
  • 2.3.13 大肠杆菌BL21（DE3）的诱导表达
  • 2.3.14 包涵体的制备
  • 2.2.15 包涵体的纯化与复性
  • 2.3.16 表达蛋白SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定
  • 1结合测定（GM1-ELISA）'>2.3.17 表达产物的GM1结合测定（GM1-ELISA）
  • 3 结果与分析
  • 3.1 ctb、np片段的扩增
  • 3.2 ctb基因和np基因的克隆与鉴定
  • 3.3 重组表达质粒pKG-ctb和pKG-np的酶切鉴定
  • 3.4 重组表达质粒pKGCN的酶切鉴定
  • 3.5 表达产物的SDS-PAGE结果
  • 3.5.1 重组蛋白rCTB和rNP表达产物的SDS-PAGE结果
  • 3.5.2 重组蛋白rCTB-NP表达产物的SDS-PAGE结果
  • 3.6 重组蛋白rNP和rCTB-NP表达产物的Western-blot检测结果
  • 1-ELISA检测'>3.7 重组蛋白rCTB和rCTB-NP表达产物的GM1-ELISA检测
  • 4 讨论
  • 4.1 表达系统的选择
  • 4.2 融合蛋白的表达及包涵体的提取
  • 1-ELISA'>4.3 GM1-ELISA
  • 5 小结
  • 第三章 传染性支气管炎病毒核蛋白粘膜免疫研究
  • 1 研究目的及意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 试验动物
  • 2.1.2 主要试剂
  • 2.1.3 主要溶液的配制
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 动物的免疫
  • 2.2.2 样品的采集与处理
  • 2.2.3 样本的ELISA检测
  • 2.2.3.1 样本IgG-NP抗体的检测
  • 2.2.3.2 样本IgA-NP抗体的检测
  • 2.2.4 数据处理
  • 3 结果与分析
  • 3.1 免疫前后血清IgG-NP、IgA-NP的ELISA检测结果
  • 3.2 免疫前后鼻腔洗液、气管洗液、肠腔洗液中sIgA-NP的ELISA检测结果
  • 4 讨论
  • 4.1 重组CTB的免疫佐剂活性
  • 4.2 免疫途径
  • 4.3 不同部位的sIgA含量
  • 4.4 CTB与外源抗原的使用方式与粘膜免疫效果的关系
  • 4.5 CTB佐剂作用与实验对象的关系
  • 4.6 IB的防制
  • 5 小结
  • 第四章 鸡传染性支气管炎ELISA检测方法的初步建立
  • 1 研究目的和意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 病毒及微生物材料
  • 2.1.2 主要试剂
  • 2.1.3 ELISA试剂的配制
  • 2.1.4 主要实验器材
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 包被抗体（Ab1）和第二抗体（Ab2）最佳工作浓度测定
  • 2.2.2 敏感性试验及临界点的确定
  • 2.2.3 特异性交叉试验
  • 2.2.4 特异性阻断叉试验
  • 2.2.5 重复性试验
  • 3 结果与分析
  • 1）和兔抗AIV抗体（Ab2）最佳工作浓度测定结果'>3.1 包被抗体（Ab1）和兔抗AIV抗体（Ab2）最佳工作浓度测定结果
  • 3.2 临界值的确定
  • 3.3 敏感性试验
  • 3.4 交叉性试验
  • 3.5 特异性阻断试验
  • 3.6 重复性试验结果
  • 4 讨论
  • 4.1 IBV检测方法的选择
  • 4.2 影响ELISA特异性的因素
  • 4.3 夹心ELISA的应用前景
  • 5 小结
  • 参考文献
  • 致谢

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    • [12].鸡传染性支气管炎的诊断技术[J]. 畜牧兽医科技信息 2015(05)
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    • [28].Polarization and absorption principle of corona virus in the electric field[J]. Journal of Harbin Institute of Technology 2008(02)
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