论文摘要
目的:本研究着眼于动脉粥样硬化斑块病变中细胞的增殖、凋亡和代谢三个方面,应用99mTc-HYNIC-PCNA ASON、99mTc-HYNIC-annexin V SPECT和18F-FDG PET/CT分别进行反义、凋亡和代谢显像,来评价分子核医学显像用于诊断动脉粥样硬化斑块的可行性及其应用价值和发展前景。方法:通过血管免疫损伤和高脂饮食喂养的方法建立动脉粥样硬化斑块兔模型,作为本研究中三种分子核医学显像研究的实验对象。应用99mTc标记的HYNIC-PCNA ASON和HYNIC-annexin V进行动脉粥样硬化反义和凋亡的SPECT显像,应用18F-FDG PET/CT进行动脉粥样硬化代谢显像。显像完毕后,对病变的血管进行放射性的测定、病理和免疫组织化学的染色等检测,研究显像与动脉粥样硬化病变的发生和发展之间的关系,以阐明不同的显像方式在诊断动脉粥样硬化病变中的应用价值。1.动脉粥样硬化动物模型的构建和鉴定雄性日本大耳白兔（华中科技大学同济医学院实验动物中心提供）用免疫损伤血管加高脂饮食的方法制备成动脉粥样硬化兔模型:将牛血清白蛋白按250mg/kg经兔耳缘静脉注射进行血管的免疫损伤,次日起按每日100g/只喂食高胆固醇饲料,其配方为普通兔饲料中加入5%猪油、5%蛋黄粉、1%胆固醇和0.1%的丙基硫氧嘧啶。造模前及高脂饮食喂养的第4、8、12w末检测血总胆固醇浓度（酶试剂法）。对照组兔不损伤血管,普食喂养12w。2. 99mTc-HYNIC-PCNA反义寡核苷酸探测兔动脉粥样硬化病变的显像研究动脉粥样硬化斑块模型兔12只,随机分为两组,分别进行99mTc-HYNIC-PCNA ASON（ASON组,n=8）和99mTc-HYNIC- PCNA正义寡核苷酸（SON组,n=4）显像。4只进行普通饲料喂养的同种白兔作为正常对照进行99mTc-HYNIC- PCNAASON显像。ASON组兔其中4只隔日进行PCNA竞争抑制性显像:先静脉注射50μg非标记的PCNA ASON,2h后注射99mTc-HYNIC- PCNA ASON进行显像。ASON组另4只兔处死后,剥离主动脉全程,进行离体血管显像。随后将血管分段,测定各片段质量和放射性计数,并进行组织的病理学检查、免疫组织化学染色（PCNA、RAM11和α-SMA染色）和PCNA表达的检测（RT-PCR和Western Blotting）,分析血管片段摄取99mTc-HYNIC-PCNA ASON与其PCNA表达的关系,及与病变中的细胞成分之间的关系。3. 99mTc-HYNIC-Annexin V兔动脉粥样硬化斑块凋亡显像的实验研究动脉粥样硬化兔和正常兔各5只,按体重自兔耳缘静脉注射99mTc-HYNIC-annexin V （37MBq/kg）,进行腹主动脉99mTc-HYNIC-annexin V显像。注射显像剂后5min、30min、1h、2h和3h行静态平面显像。显像完毕后,解剖出实验组兔的主动脉,行离体血管显影。随后将血管分段,测定各片段质量和放射性计数,并进行病理学、免疫组织化学检查和TUNEL检测,分析动脉摄取99mTc-HYNIC-annexin V与细胞凋亡程度及斑块中细胞成分间的相关性。4. 18F-FDG PET探测动脉粥样硬化斑块的显像研究5只动脉粥样硬化兔和5只正常兔进行18F-FDG PET/CT显像。注射18F-FDG后1h、2h和3h行PET/CT显像。每次采集,共采集5个床位,从兔耳到腹股沟区,视野包括头颈部和胸腹部,仰卧位。首先是采集CT图像,CT扫描参数为80 kV,30mA,层厚5 mm,重建层厚4.25mm。随即采集PET图像,采集视野间的重叠数1,每个床位5min,共25min,在采集的同时使用预重建方法重建CT衰减校正的PET图像。显像完毕后,剥离主动脉全程,将血管分段,测定各片段质量和放射性计数,并进行组织的病理学检查、RAM11染色,分析血管片段摄取18F-FDG PET与斑块中的巨噬细胞含量之间的关系。结果1.动脉粥样硬化模型的鉴定主动脉解剖出来后进行肉眼观察,可见主动脉内膜面大小不等的白色或淡黄色斑片样突起,且厚薄不均,主要分布在主动脉弓,其次在胸主动脉和腹主动脉上段。目前,动脉粥样硬化病变的分型是参考AHA（American Heart Association）的建议:I型,早期病变,独立的泡沫细胞,散在分布于内膜表面;II型,脂纹或内膜疣,由巨噬细胞来源的泡沫细胞、平滑肌和细胞外基质组成;III型,病理性内膜增厚,可见成群的泡沫细胞形成的病灶和内膜内明显的脂池;IV型,纤维帽,由有明显脂间隙的脂核（包括脂池和坏死组织）及其外覆盖的纤维帽组成,但纤维组织增生不明显;V型,大的脂核和严重的纤维增生,有时还有不同程度的钙化,V型又分为三个亚型,Va为纤维脂质斑块,Vb为以钙化为主的斑块,Vc为以胶原为主的斑块;VI型位复合型病变,细胞密度明显减低,少量细胞碎片和脂质,分为VIa斑块破裂或溃疡、VIb壁内血肿或出血和VIc血栓形成三个亚型。本研究中,血管片段组织切片HE染色可见病变血管壁内膜增厚,血管平滑肌和基质增多,内膜下泡沫细胞堆积,有的病变在平滑肌细胞间还可见脂池,有的病变已经形成了纤维帽。按AHA分型为动脉粥样硬化IIIV型。本研究中并未见斑块的出血、破裂和血栓形成。动脉粥样硬化血管免疫组织化学染色结果显示:RAM11阳性细胞主要分布于斑块的肩部和基底部,而α-SMA阳性细胞除了见于血管中层,在斑块组织多见于周边部位。而正常血管片段RAM11染色为阴性。2.99mTc-HYNIC-PCNA ASON显像结果HYNIC-ASON和HYNIC-SON的99mTc标记率分别为（ 64.13±4.06 ） %和（63.87±4.26）%,放化纯分别均在90%以上。显像剂注射后2h,仅ASON组99mTc-HYNIC- PCNA ASON显像可见主动脉放射性摄取明显增高,SON组、正常对照组和竞争性抑制显像均未见主动脉有明显的显像剂摄取。血管离体显像病变相应部位也可见异常显像剂摄取。ASON组血管片段的%ID/g值为0.033±0.011,明显高于SON组（0.013±0.004,F=106.38,P<0.001）和正常对照组（0.014±0.004,F=96.91,P<0.001）。ASON组非靶器官的放射性分布主要见于肾脏（0.047±0.006）,其次为肝脏（0.023±0.003）和脾脏（0.019±0.003）,与SON组和正常对照组相比,未见明显差别。在病变的早期,PCNA阳性细胞主要见于血管中层,部分分布于新生的斑块组织中;随着斑块病变的发展,绝大部分PCNA阳性细胞分布于粥样硬化斑块内,主要分布在斑块的肩部和基底部,部分分布于斑块的纤维帽。血管片段的%ID/g值与血管中PCNA指数（%）、PCNA蛋白表达密度均密切相关（r=0.69, P<0.001;r=0.78,P<0.001）。99mTc-HYNIC-PCNA ASON的摄取与斑块中巨噬细胞的含量（%）成明显相关（r=0.59, P<0.001）,与平滑肌细胞的含量（cm2）也呈线性相关,但相关性稍低（r=0.54, P<0.001）。3. 99mTc-HYNIC-annexin V凋亡显像结果99mTc-HYNIC-annexin V的标记率为（96.32±2.08）%,放化纯为（96.90±2.27）%。实验组兔在显像的各个时段均可见沿主动脉走行的放射性条状影,显像剂摄取呈不均匀性增加,2h时显影最清晰;而对照组未见明显的放射性摄取,前者靶/非靶比值（2.70±0.26）明显高于后者（1.30±0.13）,P<0.001。实验组兔的主动脉血管斑块片段的放射性摄取是非斑块血管片段的（2.55±0.69）倍,斑块片段的放射性摄取%ID/g为0.058±0.014,明显高于非斑块血管片段（0.020±0.012）,P<0.001。TUNEL阳性细胞绝大部分分布于斑块组织中。99mTc-HYNIC-annexin V的摄取与AI（%）成正相关（r=0.82,P<0.001）。血管片段的%ID/g值也和斑块中巨噬细胞的含量（%）密切相关（r=0.75,P<0.001）,但是与斑块中血管平滑肌细胞的含量（%）关系不大（r=0.34,P>0.05）。4. 18F-FDG PET/CT显像结果实验组兔在注射18F-FDG后胸主动脉血管壁可见异常的显像剂摄取病灶,1h、2h和3hSUV值分别为1.34±0.17,1.45±0.18和1.41±0.20,无统计学差异（P>0.05）;显像剂注射后2h时SUV值明显高于对照组2h的SUV值（1.07±0.11）,F =65.43,P<0.001。主动脉的胸腔段PET和CT均可见阳性病灶,18F-FDG摄取异常的病灶共20处,CT密度异常改变的病灶共23处,而且病灶的分布大部分不相同。斑块血管片段的DUR值（1.42±0.38）明显高于非斑块片段（0.55±0.36,F=68.9,P<0.001）,血管片段的DUR值与斑块中巨噬细胞含量成明显的正相关（r=0.84,P<0.001）。结论在通过血管免疫损伤合并高脂饮食成功制备的兔动脉粥样硬化模型上,三种显像方法均获得了阳性的结果。99mTc-HYNIC- PCNA ASON可以被兔动脉粥样硬化病变中异常增生的细胞特异性摄取而显示病变部位,99mTc标记PCNA反义寡核苷酸有望成为新型的反义探针,在分子水平上进行动脉粥样硬化病变的早期、特异性诊断。99mTc-HYNIC-annexin V凋亡显像可以无创性地检测动脉粥样硬化斑块中的细胞凋亡从而了解斑块的定位和不稳定性,使患者能获得及时的诊治,降低急性心血管病的发生率。18F-FDG PET/CT兔主动脉粥样斑块体内显像可以对斑块进行清晰的定位,并可通过显示斑块中炎性细胞的代谢状态来评价斑块的不稳定性。因此,分子核医学针对动脉粥样硬化中不同的靶点,利用放射性核素标记相应的分子探针,进行动脉粥样硬化显像,不仅可以早期无创性显示斑块,更可评价斑块的稳定性,具有重要的临床价值和广阔的发展前景。