论文摘要
核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib)de Bary)是一种放线状子囊真菌,其寄主范围和地理分布十分广泛,是一种相当严重的世界性植物真菌病害。在我国,油菜菌核病居油菜三大病害之首,严重影响了我国的油菜生产。目前,其近缘种中还没有发现高抗或免疫的种质资源,油菜对菌核病仅具有一定的抗性,表现为数量性状,易受环境的影响,加之缺乏准确可靠的病害鉴定方法,使得常规育种难以选择到稳定的抗病植株。最新研究表明在植物体内表达可识别病菌特异抗原的重组抗体,可作为一种全新的用途广泛的植物真菌病害防治有效方法。本研究制备了核盘菌细胞壁和细胞壁蛋白抗原,用于免疫鸡和小鼠。取鸡最后一次免疫后的第5天的鸡蛋,从鸡蛋黄中纯化鸡多克隆抗体,且在优化的条件下检测了抗原免疫产生抗体的特异性和亲和力。结果显示鸡产生的多克隆抗体亲和力高,但在不同抗原之间存在一定的交叉反应;分离鼠最后一次免疫后第5天的鼠血清用于检测鼠多克隆抗体滴度,结果显示鼠多克隆抗体亲和力高特异性好。分离免疫动物脾脏组织总RNA,再纯化mRNA以及合成cDNA,并以cDNA为摸板PCR扩展重链可变区和轻链可变区。将重链可变区和轻链可变区分别导入噬菌体展示载体中构建重链可变区和轻链可变区文库,文库的库容量均为5×10~4个含有400 bp插入片段的单克隆。从重链可变区文库中酶切回收的重链可变区片段克隆到轻链可变区文库中构建重链到轻链单链抗体可变区文库,反之构建轻链到重链的单链抗体可变区文库。两个单链抗体文库总库容量为1×10~6左右。通过噬菌体展示筛选构建的鸡单链抗体可变区文库,几轮淘选后得到一个单链抗体。本研究为利用抗体构建可提高核盘菌抗性的特异抗体融合蛋白提供了材料。