GSK-3β在白藜芦醇引起的心肌线粒体保护中的作用及其机制研究

论文摘要

研究目的:1研究白藜芦醇是否通过抑制mPTP的开放来发挥心脏保护作用。2研究白藜芦醇是否通过抑制GSK-3β的活性而阻止mPTP的开放。3探讨白藜芦醇抑制GSK-3β活性的可能信号转导机制。研究方法:本实验选用大鼠胚胎心脏组织来源的H9c2细胞株为研究对象。并用H2O2（600μM）造成H9c2细胞线粒体氧化应激损伤。采用四甲基罗丹明乙酯（tetramethyrhodamine ester, TMRE）进行荧光染色并通过激光扫描共聚焦显微镜成像法测定H9c2细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,ΔΨm）的变化,以判断mPTP的开放程度,进而确定线粒体的损伤程度。用SABC法检测白藜芦醇对H9c2细胞GSK-3β（Ser9）位点磷酸化的影响。应用Western blot法检测GSK-3β（Ser9）磷酸化、血管扩张刺激磷蛋白（Vasodilator stimulated phosphoprotion, VASP）(Ser239)的改变。采用DAF-FM DA（3-amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein, diacetate）进行荧光染色并用激光共聚焦显微镜检测白藜芦醇对细胞内一氧化氮（nitric oxide）含量的影响。研究结果:1激光共聚焦显微镜检测结果显示,用H2O（2600μM）处理H9c2细胞20 min后,TMRE荧光强度明显减弱（38.6±1.9%）。与H2O2对照组相比,用不同浓度白藜芦醇（0.01μM-20μM）预处理后,均能够抑制TMRE荧光强度的减少,且差异具有统计学意义（p<0.05）,其中5.0μM效果最明显（81.9±1.1%）。2 Western blot结果显示,与空白对照组相比（100±1.4%）,不同浓度白藜芦醇（0.01μM-20μM）均能使GSK-3β（Ser9）的磷酸化增加,其中5.0μM效果最明显（160.6±3.6%）。用SABC法对GSK-3β在H9c2进行免疫荧光染色,经共聚焦显微镜观察结果显示白藜芦醇组GSK-3β（Ser9）的磷酸化明显增加。3与H2O2对照组相比（38.6±1.9%）,白藜芦醇（5.0μM）抑制TMRE荧光强度减弱的作用（81.9±1.1%）,可被蛋白酶G（Protein Kinase G, PKG）的抑制剂KT5823（1μM）所阻断（41.8±1.2%）,白藜芦醇（5.0μM）促进GSK-3β（Ser9）磷酸化的作用也被KT5823（1μM）阻断,提示白藜芦醇可能通过cGMP-PKG信号通路调节GSK-3β（Ser9）的磷酸化而发挥心肌保护作用。进一步Western blot结果显示,与对照组相比（100±1.4%）,白藜芦醇（5.0μM）使VASP(Ser239)的磷酸化明显增多（157.9±1.3%）,此作用同样可被KT5823（1μM）所抑制（98.0±0.5%）。4此外,与空白对照组（77.0±5.4%）相比,H9c2细胞经白藜芦醇（5.0μM）预处理后,DAF-FM荧光强度无明显增强（71.2±5.3%）。结论:1白藜芦醇通过抑制mPTP的开放而减轻氧化应激引起的线粒体损伤。2白藜芦醇通过使GSK-3β（Ser9）磷酸化而失活,进而抑制mPTP的开放。3白藜芦醇抑制GSK-3β活性的作用可能与cGMP/PKG信号通路有关。4 NO可能未参与白藜芦醇的线粒体保护作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 参考文献
• 致谢
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