论文摘要
亲和色谱是一种高效简便的蛋白纯化分离技术，高效亲和色谱（HPAC）是在经典亲和色谱技术上结合高效液相色谱（HPLC）的特点发展起来的新技术，它具有分离速度快、分离效果好、回收率高和操作简单等优点，适用于批量样品的分析和制备。8微米左右的表面多孔单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯／甲基丙烯酸乙二醇酯P（GMA-EDMA）微球可作为高效液相色谱柱填料中的基质材料。本文将P（GMA-EDMA）微球作为高效液相色谱的基质材料，三嗪染料和金属作为亲和配基，制备一种新型的复合配基亲和色谱填料并将其用于对蛋白质的分离纯化，主要做了以下研究工作：1．以分散聚合法制备的2微米聚苯乙烯微球为种子，GMA、EDMA为单体，用一步种子溶胀法制备了表面多孔的P（GMA-EDMA）微球。该微球7微米左右，粒径单分散，表面多孔，刚性好，适合用做高效色谱柱填料。2．以自制P（GMA-EDMA）微球为基球，通过不同的连接方式，将染料配基PBMX-R和金属Ni2+固定在基球上，制备成两种复合配基高效亲和色谱填料Ni2+-IDA-PB-P（GMA-EDMA）和Ni2+-PB-P（GMA-EDMA）。3．用匀浆法将所制的复合配基亲和色谱填料填装成高效亲和色谱柱，通过比较复合配基亲和色谱与单一亲和配基亲和色谱对蛋白质的保留行为和吸附情况，探究复合配基亲和色谱对蛋白质的保留机理，将含有染料配基和金属配基的Ni2+-IDA-PB-P（GMA-EDMA）、Ni2+-PB-P（GMA-EDMA）复合配基亲和色谱柱与含有单一配基的亲和色谱柱对蛋白质的吸附情况进行比较，选择最佳色谱柱。4．在10×0.46cm的Ni2+-IDA-PB-P（GMA-EDMA）色谱柱上，探讨了pH、流速和固定了不同金属离子的色谱柱对溶菌酶分离的影响，得出溶菌酶的最佳淋洗条件为：流动相A为0.02mol／L pH6.86磷酸盐缓冲液，B为含1.0mol／L NaCl的pH6.86磷酸盐缓冲液，淋洗梯度为15minB从0到100％，进样量为20μL，流速为0.5ml／min。在最佳淋洗条件下对不同浓度溶菌酶进行测定，该高效亲和色谱柱具有良好的线性、重现性、稳定性等色谱性能。实际应用中，它能将鸡蛋清样品中的溶菌酶成功分离，并从猪心中分离纯化出高浓度的细胞色素C。