氨基酸对大肠杆菌BL21生长及重组蛋白合成影响研究

论文摘要

本文首先考察了无机氮源浓度对大肠杆菌生长的影响,建立了几种氮源限制培养基。在氮源限制条件下,以无机氮源作为对照,考察了复合有机氮源对大肠杆菌生长的影响,并优化了诱导时间、诱导剂添加量等因素进而研究了有机氮源对大肠杆菌重组蛋白合成的影响,发现复合有机氮源不仅能促进大肠杆菌生长而且还能促进其重组蛋白的表达。随后又在合成培养基中考察了游离氨基酸对大肠杆菌生长及重组蛋白合成的影响,结果表明,在某些条件下,相比无机氮源而言,部分游离氨基酸能促进大肠杆菌生长以及重组蛋白的表达。通过深入分析,认为氨基酸对其生长及蛋白表达的促进作用可能与编码ppGpp合成酶的relA基因有关。本研究采用Red重组系统成功使relA基因失活,并对突变菌株开展了系列类似研究,发现很多能促进原始菌株生长及蛋白表达的氨基酸在相同条件下无法促进突变菌株的生长,而且在两株菌具有几乎一致的生长表型的LB培养基中突变株的合成重组蛋白能力明显不如野生菌,结果表明,relA基因在氨基酸对大肠杆菌生长促进及外源蛋白合成方面确实起着重要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 大肠杆菌生长
• 1.1.1 影响大肠杆菌生长的因素
• 1.1.2 大肠杆菌生长的表观
• 1.2 大肠杆菌氮源同化
• 1.2.1 细胞对不同氨浓度的响应
• 1.2.2 PII蛋白介导的谷氨酰胺合成酶的活性调节
• 1.2.3 鲁棒条件下AT/AR介导的GS活性的调节
• 1.3 氨基酸
• 1.3.1 氨基酸概述
• 1.3.2 氨基酸的生物合成
• 1.3.3 氨基酸的利用
• 1.4 relA与ppGpp
• 1.4.1 relA与ppGpp关系
• 1.4.2 ppGpp的作用机制
• 1.5 Red重组系统
• 1.6 本文的研究目的及内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 培养条件
• 2.1.5 试剂以及仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 大肠杆菌生长监测
• 2.2.2 嘧啶核苷磷酸化酶（PyNPase）及嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）的酶活测定
• 2.2.3 其它分子生物学操作
• 第3章 有机氮源促进菌体生长及蛋白表达研究
• 3.1 条件的确立
• 3.1.1 氮源限制培养基的设计
• 3.1.2 摇床转速影响
• 3.1.3 有机氮与无机氮生长相当条件的确立
• 3.2 微生物分别在有机氮源和无机氮源中生长过程
• 3.3 有机氮源促进重组蛋白表达
• 3.3.1 重组蛋白表达的定量
• 3.3.2 多种条件下有机氮源与无机氮源蛋白表达差异微弱
• 3.3.3 一定条件下有机氮源促重组进蛋白表达
• 3.4 本章小结
• 第4章 合成培养基中氨基酸对生长及重组蛋白表达的影响
• 4.1 氨基酸对大肠杆菌生长的影响
• 4.1.1 单一氨基酸作氮源时对大肠杆菌生长影响
• 4.1.2 无机氮条件下氨基酸促进大肠杆菌生长
• 4.1.3 氨基酸互配时能促进大肠杆菌生长
• 4.2 氨基酸能促进对大肠杆菌重组蛋白的表达
• 4.3 本章小结
• 第5章 relA基因在大肠杆菌生长及外源蛋白表达方面作用的研究
• 5.1 ΔrelA E.coli BL21构建
• 5.2 ΔrelA E.coli BL21菌株生长特性
• 5.2.1 有机氮源条件下ΔrelA E.coli BL21生长情况
• 5.2.2 无机氮条件下敲除菌生长特性
• 5.3 氨基酸对敲除菌株生长的影响
• 5.3.1 敲除菌利用氨基酸作唯一氮源时生长情况
• 5.3.2 无机氮条件下氨基酸对大肠杆菌生长促进作用依赖于relA
• 5.3.3 氨基酸互配时对生长促进作用部分依赖于relA
• 5.4 relA基因对大肠杆菌外源蛋白表达的影响
• 5.4.1 重组突变株的构建
• 5.4.2 LB培养基中relA基因的缺失不利于重组蛋白的表达
• 5.5 本章小结
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢