金黄色节杆菌SK8.001产菊糖果糖转移酶的发酵工艺研究

论文摘要

双果糖酐(DFA III)是近年来人们发现的一种新型天然功能性甜味剂,能促进钙、铁、镁、锌和铜等矿物质元素,促进骨骼生长,利于排尿,预防结肠癌等功能,同时甜度较高,能量值较低,具有耐酸、耐热和不易吸湿等优良的理化性质,特别适用于糖尿病病人食品、饮料、糖果和医药制剂中。目前国外主要是采用菊糖果糖转移酶(IFTase)转化菊糖来生产双果糖酐,并已有商业化产品面市。而目前国内在这个领域的研究尚处于空白。本文利用经实验室筛选所得的一株金黄色节杆菌SK 8.001发酵生产IFTase,主要研究了种子培养基优化、发酵培养基优化、摇瓶培养环境优化、3 L全自动发酵罐中搅拌转速控制的优化和发酵温度控制的优化以及在摇瓶发酵过程中菊糖和DFAⅢ补料。在本文中,通过从9种活化培养基中筛选出较为合适的活化种子培养基,其具体成分为(g/L):蛋白胨(鱼粉)5、牛肉膏3、NaCl 5、pH 7.0、28℃。随后确立了最佳种龄为24 h。优化了节杆菌SK 8.001发酵产菊糖果糖转移酶IFTase的培养基,最终得出的培养基配方为(g/L):菊糖25,NaNO3 3、酵母膏1、KH2PO4 0.4、MgSO4 0.1、FeSO4·7H2O 0.01。IFTase活力从原来的9 U/mL提高到18.2 U/mL。优化了节杆菌SK 8.001在经优化后的产菊糖果糖转移酶IFTase培养基上生长的其他摇瓶培养条件,最终确立的最佳条件为:28℃、4%的接种量、10%的装液量以及7.0的起始pH。最终IFTase活力达到32.5 U/mL。在3L全自动发酵罐中研究了不同搅拌转速对IFTase合成的影响,估算描述菌体生长状况的发酵动力学参数比生长速率μ和描述IFTase合成状况的参数Qp后,综合考虑菌体生长和IFTase和合成的需求,采取两阶段搅拌转速控制方法,具体为发酵过程前20 h采用500 r/min,在20 h以后采用600 r/min。最后验证结果为:IFTase最高活力达到39.72U/mL。在两阶段搅拌转速控制方法的基础上进一步研究了温度对节杆菌SK 8.001合成IFTase的影响。采取两阶段温度控制方法,具体为发酵过程前5h采用34℃,5h以后采用28℃。最后验证结果为:IFTase最高活力可以达到41U/mL。为在发酵罐中的补料做准备,初步研究了添加菊糖和DFAⅢ对IFTase合成的影响。结果显示:在12 h时添加15 g/L的菊糖可以将IFTase活力提高到36.24 U/mL,在12 h时添加0.1 g/L的DFA III可以将IFTase活力提高到37.1 U/mL。由此可以看出在工业化生产时补加DFA III可以经济而高效地提高IFTase的合成水平。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 引言
• 1.1 立题背景和意义
• 1.2 双果糖酐研究概述
• 1.3 DFA III 的生产现状概述
• 1.4 菊糖果糖转移酶（IFTASE）的研究现状概述
• 1.4.1 催化机理
• 1.4.2 产IFTase 的微生物菌株
• 1.4.3 金黄色节杆菌所产IFTase 的酶学性质研究
• 1.4.4 发酵生产IFTase 的过程研究
• 1.5 本论文主要研究内容
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂和仪器
• 2.1.3 培养基
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 培养方法
• 2.2.2 粗酶液的制备
• 2.2.3 细胞干重测定方法
• 2.2.4 酶活力测定方法
• 2.2.5 发酵液中糖分分析方法
• 3 含量检测方法'>2.2.6 发酵液中主要氮源NaNO₃含量检测方法
• 2.2.7 筛选种子活化培养基
• 2.2.8 摇瓶发酵培养基的优化
• 2.2.9 摇瓶发酵条件的优化
• 2.2.10 3L发酵罐中分批发酵的溶氧控制方法
• 2.2.11 3L发酵罐中分批发酵的温度控制方法
• 2.2.12 摇瓶发酵过程中碳源添加对菊糖果糖转移酶合成影响的初步研究
• 3. 结果与讨论
• 3.1 筛选种子活化培养基及接种种龄的确定
• 3.2 产IFTASE 的发酵培养基优化
• 3.2.1 碳源对金黄色节杆菌SK 8.001 产IFTase 活力的影响
• 3.2.2 氮源对金黄色节杆菌SK 8.001 产IFTase 活力的影响
• 3和酵母膏浓度的单因素试验'>3.2.3 不同菊粉、NaNO₃和酵母膏浓度的单因素试验
• 3.2.4 磷酸盐对金黄色节杆菌SK 8.001 产IFTase 活力的影响
• 3.2.5 金属离子对金黄色节杆菌SK 8.001 产IFTase 活力的影响
• 3.2.6 正交试验
• 3.3 摇瓶发酵生产菊糖果糖转移酶条件的优化
• 3.3.1 摇瓶发酵过程中起始pH 对IFTase 合成的影响
• 3.3.2 摇瓶发酵过程中接种量对IFTase 合成的影响
• 3.3.3 摇瓶发酵过程中装液量对IFTase 合成的影响
• 3.3.4 摇瓶发酵过程中温度对IFTase 合成的影响
• 3.3.5 优化前后的摇瓶发酵过程曲线比较
• 3.4 3L 发酵罐中分批发酵的溶氧控制方法确定
• 3.4.1 通气量的选择
• 3.4.2 搅拌转速对IFTase 合成的影响
• 3.4.3 两阶段搅拌转速控制方法
• 3.5 3L 发酵罐中分批发酵的温度控制方法确定
• 3.5.1 发酵温度对IFTase 合成的影响
• 3.5.2 两阶段温度控制方法
• 3.6 摇瓶发酵过程中碳源补料的初步研究
• 4. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 硕士在读期间已发表论文