宫颈癌差异表达新基因抑癌功能及机制的研究

论文摘要

宫颈癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一。尽管高危型人乳头瘤病毒的感染是导致宫颈癌发生的重要危险因素,然而,和其他肿瘤一样,宫颈癌的发生和发展也是一个多因素、多步骤的复杂过程。其病因和发病机制并未完全了解。我科室利用基因表达芯片筛选发现了一个在原发性宫颈癌组织中表达下降最为明显的基因------膀胱癌相关蛋白基因（Homo sapiens bladder cancer related protein,BLCAP）。该基因定位于染色体20q11.2-q12,编码87个氨基酸。研究表明,BLCAP基因在进化上高度保守,并推测该基因在基因组中发挥着重要的作用。然而,国内外对其功能和机制的研究还很有限。为了解该基因在宫颈癌发生发展中的作用,以及探讨其在宫颈癌中作为候选抑癌基因的可能机制,我们利用宫颈癌细胞系（HeLa）作为研究对象进一步研究其抑瘤功能,并通过特异性甲基化PCR方法,研究该基因表达下调的可能机制。本研究首先用RT-PCR方法检测来自不同地区的54例宫颈癌组织和25例正常宫颈组织标本,发现BLCAP基因在正常组织中能够表达,其阳性表达率为100%（25/25）,但是在宫颈癌组织标本中明显降低,甚至缺失,缺失率为40.7%（22/54）;对癌组织和正常组织中的BLCAP表达进行半定量分析,在癌组织中,其半定量校正值为0.207±0.265,宫颈正常组织为0.650±0.113,BLCAP在宫颈癌中的表达和正常组织相比明显降低,差异显著,具有统计学意义（t=-7.985, P<0.01）。这些结果与先前所做的基因芯片研究结果一致。研究还发现,BLCAP的表达与宫颈癌临床分期、淋巴节浸润和转移明显相关,但是与病理类型、年龄及人乳头瘤病毒（HPV）感染等无关（P>0.05）。为了进一步了解BLCAP基因的抑癌功能,我们构建了pCMV-Tag-BLCAP重组质粒,转染HeLa细胞后,通过细胞形态学观察,我们发现未转染组和转染了载体组的HeLa细胞生长良好,而转染了BLCAP基因的HeLa细胞生长却受到了明显的抑制,细胞在第六天开始出现了明显变化,细胞增殖速度明显低于对照组细胞。软琼脂集落形成实验结果表明,转染了BLCAP基因的HeLa细胞在软琼脂中的集落大小和数目都减少,集落形成率为5.6±1.20%,和空白对照（未转染组为33.0±1.36%,转染空载体组为32.4±1.18%）相比,集落形成能力明显受到了抑制;Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡,在共聚焦显微镜下观察到转染了BLCAP基因的细胞出现了明显的细胞核浓缩、分叶、碎裂等凋亡现象,而对照组细胞核染色均匀,核膜完整,凋亡核像偶见;流式细胞仪分析显示,转染BLCAP基因后,HeLa细胞在G1期细胞数目增多,S期缩短,细胞生长周期出现了明显的阻滞现象。抑癌基因是一类抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因。抑癌基因的失活在肿瘤发生发展中起着重要的作用。而基因调控区的异常高甲基化是其表达下调或缺失的重要机制之一。为了探讨BLCAP基因在组织和细胞中的表达下调的机制,我们利用特异性甲基化PCR（MS-PCR）的方法,对59例宫颈癌组织和25例正常组织的BLCAP上游CpG丰富区和外显子CpG岛的甲基化情况进行了研究。结果表明,和正常宫颈组织相比,在癌组织的上游CpG丰富区域甲基化程度并未发生明显变化,而在其外显子区域的CpG岛区甲基化阳性率明显增高,其甲基化阳性率为71.2%,正常宫颈组织的该区域甲基化阳性率为0.0%,两者相比较,差异具有显著性（P<0.01）。该区域的甲基化是引起BLCAP转录水平下调表达的可能机制。综上所述,我们通过对BLCAP的功能和机制的探讨,初步确定其为宫颈癌相关抑癌基因,其外显子区域的CpG岛异常甲基化,是造成抑癌功能丧失的原因之一,该基因及其编码蛋白的作用机理及方式还有待进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 正文
• 第一部分 BLCAP 在宫颈癌组织中的表达及其临床意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 BLCAP 基因在 HeLa 细胞中的功能特性研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 BLCAP 基因上游 CpG 丰富区和外显子区域 CpG 岛甲基化的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 正文
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文及科研成果
• 后记