基于汉逊酵母细胞的新型乙肝表面抗原疫苗的研究

论文摘要

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是世界性的公共卫生问题,其所致的慢性肝炎及其并发症严重危害了人类健康。据统计,全球有3.7亿左右的HBV感染者或病毒携带者。每年至少有100万人死于慢性肝脏疾病,包括肝硬化和肝癌。目前,临床上对慢性肝炎的治疗主要是采用干扰素α和核苷类药物。但是,治疗效果不理想。疫苗是控制乙肝传播最有效的手段。目前国内外使用的乙肝疫苗主要由两部分组成,乙肝表面抗原（HBsAg）和佐剂,单独乙肝表面抗原（HBsAg）的免疫原性较弱,佐剂用于增强抗原的免疫原性。目前被批准应用于临床的佐剂只有氢氧化铝（alum）,其主要增强Th2型免疫应答,以体液免疫为主。对于HBV慢性感染者而言,机体免疫反应不能有效清除病原体,一般认为机体对HBV产生了免疫耐受。打破慢性HBV感染的免疫耐受状态,有效地激活机体特异性体液免疫和细胞免疫是治疗慢性肝炎的关键之一。研究表明,Th1型免疫以较强的细胞免疫和适度的体液免疫反应为特点,在宿主抵抗病毒、胞内菌感染方面起重要作用。因此,开发一种安全的,能够增强Th1型免疫应答的佐剂,对控制乙肝具有重要的意义。TOLL样受体（TLRs）属于病原相关分子模式识别受体（PRR）,PRR识别某些病原微生物或其产物所共有的高度保守的特定分子结构称为病原相关分子模式（PAMP）。TLRs与PAMP相互作用,不仅能激活先天性免疫应答,而且还能促进抗原提呈细胞（APCs）识别病原体,产生共刺激信号而启动获得性免疫反应,是联系先天免疫和获得性免疫的桥梁。现在已经有11种不同的TLRs配体被识别,许多种TLRs配体被用作疫苗佐剂的研究,如R.848和CpG分别是TLR7和TLR9的配体。树突状细胞（DCs）表面表达多种TLRs,在识别病原微生物表面PAMP及基因如CpG-ODN、单链和双链RNA方面起重要作用。激活后的DCs转向成熟阶段,MHCⅠ、Ⅱ类分子及共刺激分子CD40,CD80,CD86表达增高,并分泌IL-12、IFN-γ等细胞因子,促进NK细胞、巨噬细胞吞噬杀伤病原体的活性,增强天然免疫应答。此时DCs抗原摄取能力大为降低,而抗原提呈能力增强,DCs迁移至次级淋巴组织,将抗原以MHC-抗原肽形式递呈给T淋巴细胞,激活特异性细胞和体液免疫反应。TLRs还可决定获得性免疫的类型,大多数TLRs配体能够诱生Th1型获得性免疫反应。已有研究表明,酵母细胞壁有很多佐剂成分,其能够与DCs和巨噬细胞受体相互作用,这些受体包括TLR-2,TLR-4,TLR-6,CD14,Dectin-1,Dectin-2,DEC-205和甘露糖受体家族。酵母细胞被DCs吞噬以后,可以上调很多细胞表面分子的表达,包括粘附分子（ICAM-1,CD54）,协同刺激因子（B7-1,B7-2,CD80,CD86）,MHCⅠ和MHCⅡ类分子,并刺激细胞因子IL-12的分泌。研究表明,酿酒酵母本身没有致病性,临床研究表明,热灭活的重组酵母在机体中没有明显的副作用。利用热灭活的表达肿瘤相关抗原的酿酒酵母细胞免疫小鼠能够产生针对肿瘤抗原特异性的T细胞免疫应答和抗肿瘤活性。肿瘤相关抗原可通过MHCⅠ和MHCⅡ类分子交叉提呈,从而产生针对肿瘤相关抗原特异性Th和CTL介导的免疫应答。然而,酿酒酵母表达体系中还有一些不足之处,例如酿酒酵母产生的糖基化蛋白中,N-连接的聚糖可以产生过敏反应。此外,这种酵母所用碳源有限。汉逊酵母是一种甲基营养型酵母,其能克服传统酵母的不足,在汉逊酵母表达的糖蛋白中,N-连接的聚糖不会产生过敏反应。汉逊酵母的碳源比较丰富,其蛋白的产量比传统的酿酒酵母高,并且汉逊酵母本身没有致病性,可以推测汉逊酵母细胞可能是一种更加安全有效的疫苗佐剂。为评价重组汉逊酵母在疫苗佐剂中的应用和汉逊酵母的特性,本研究拟应用热灭活的表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞（Yeast-HBsAg）和酵母细胞空载体,研究在小鼠体内诱生HBsAg特异性T细胞和B细胞免疫应答的能力。首先设计表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞。为了提高汉逊酵母细胞HBsAg的表达水平,对HBsAg基因密码子进行优化,尽量采用汉逊酵母细胞偏爱的密码子。PCR方法扩增出HBsAg的基因序列,将基因序列亚克隆到多拷贝表达载体中,然后将其电转到汉逊酵母细胞中,诱导表达HBsAg。经检测发现,HBsAg主要表达在汉逊酵母细胞内。为比较分析酵母细胞成分的佐剂作用,同时制备热灭活的表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞（Yeast-HBsAg）和汉逊酵母细胞空载体（Yeast vector）。为评估上述制品在小鼠体内诱生免疫应答的水平和特征,取6周龄BALB/c雌鼠,随机分为5组,每组10只小鼠,分别利用PBS,HBsAg,HBsAg+alum（以alum作为HBsAg佐剂）,Yeast vector,Yeast-HBsAg免疫小鼠。每4周免疫1次,共免疫3次。初次免疫2周后开始眼眶后静脉丛插管采血,每隔2周采血1次。稀释不同免疫组小鼠血清,然后用ELISA法检测血清中anti-HBs IgG以及IgG1,IgG2a的抗体滴度。第3次免疫后1周,脱颈椎处死小鼠,无菌条件下摘取脾脏,然后用氯化铵溶液裂解红细胞,胎盘兰染色,脾脏细胞计数。将小鼠脾脏细胞调整为2×106/ml,作细胞表面分子染色,包括CD11c,CD80,CD86,MHCⅡ;CD3,CD4,CD8。用流式细胞仪检测小鼠脾脏DCs（CD11c）,以及共表达CD80,CD86和MHCⅡ的DCs;小鼠脾脏T（CD3+）细胞,以及CD4+T,CD8+T细胞,CellQuest软件分析结果。计算DCs,T细胞占全脾脏细胞的比例,以及CD4+T,CD8+T细胞在全脾脏T细胞中的比例。将脾脏细胞调整为4×106/ml,加入乙肝表面抗原（终浓度20μg/ml）刺激72小时,收集上清,ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的水平。另一方面,将脾脏细胞调整为4×106/ml,加入乙肝表面抗原（终浓度20μg/ml）刺激72小时,加入CCK-8溶液,检测脾脏细胞的增殖。此外,进一步用HBsAg抗原刺激脾脏细胞,做细胞内细胞因子IFN-γ染色,流式细胞仪检测脾脏CD4+T,CD8+T细胞产生IFN-γ的水平,CellQuest分析实验结果。进一步将小鼠脾脏细胞调整为2×106/ml,利用灭活的P815-s刺激脾脏细胞,检测各组小鼠脾脏细胞的特异性杀伤活性。结果表明,Yeast-HBsAg免疫的小鼠全脾脏细胞数是HBsAg单独免疫组的5.6倍,脾脏DCs是HBsAg单独免疫组的13.6倍,脾脏T细胞数是HBsAg单独免疫组的4.4倍。HBsAg+alum免疫小鼠的全脾脏细胞数,DCs及T细胞数均为HBsAg单独免疫组的2.2倍左右。因此,与alum相比,汉逊酵母细胞能够诱导更多的T细胞,DCs向脾脏聚集。Yeast-HBsAg能够提高小鼠脾脏细胞表达CD80,CD86,MHC classⅡ的DCs比例。而HBsAg,HBsAg+alum对小鼠脾脏DCs比例没有显著的影响。Yeast vector和Yeast-HBsAg对小鼠全脾脏细胞数、DCs、T细胞数以及表达CD80,CD86,MHC classⅡ的DCs比例的影响没有显著差异,因此,Yeast-HBsAg对脾脏免疫细胞的影响主要是汉逊酵母细胞的作用。Yeast-HBsAg免疫的小鼠能够产生较高水平的IgG,IgG1,IgG2a抗体。初次免疫6周后,Yeast-HBsAg免疫小鼠产生的抗体是HBsAg单独免疫组的50倍,HBsAg+alum免疫小鼠产生的抗体是HBsAg单独免疫组的12倍。因此,Yeast-HBsAg免疫小鼠产生的抗体明显高于HBsAg+alum组。与HBsAg单独免疫组相比,Yeast-HBsAg能够提高血清IgG2a/IgG1抗体的比值（HBsAg免疫组为0.195,Yeast-HBsAg免疫组为0.522）,表明Yeast-HBsAg可以使免疫反应偏向Th1方向。而alum作为HBsAg的佐剂不能够提高IgG2a/IgG1的比值。Yeast-HBsAg免疫小鼠的脾脏细胞不但能够发生明显的增殖,而且能释放大量的HBsAg特异性IFN-γ和IL-4。此外,脾脏CD4+T和CD8+T细胞均能够产生IFN-γ。而HBsAg+alum免疫组没有检测到T细胞免疫反应。以上结果表明,Yeast-HBsAg既能够诱导Th1方向的免疫应答,也可以增强Th2方向的免疫应答,同时,Yeast-HBsAg还能够促进DCs成熟。而alum作为HBsAg的佐剂,只能增强Th2方向的免疫反应,不能诱生Th1方向的免疫应答,不能促进DCs成熟。为单独评价汉逊酵母的疫苗佐剂作用,将酵母细胞空载体（Yeast vector）与HBsAg组合[以（HBsAg+yeast）表示HBsAg与汉逊酵母细胞空载体（Yeast vector）混合]免疫小鼠,研究HBsAg+yeast在小鼠体内的免疫反应。取6周龄BALB/c雌鼠随机分为5组,每组10只小鼠,分别利用PBS,HBsAg,HBsAg+alum,Yeast vector,HBsAg+yeast免疫小鼠。每4周免疫1次,共免疫3次。眼眶后静脉丛插管采血,ELISA法检测血清中anti-HBs IgG以及IgG1,IgG2a抗体的滴度。第3次免疫后1周,处死小鼠,分离脾脏细胞,HBsAg抗原刺激,分别检测脾脏细胞增殖,IFN-γ和IL-4的分泌及脾脏CD4+T,CD8+T细胞产生IFN-γ的水平。试验结果表明,HBsAg+yeast免疫的小鼠能够产生较高水平的IgG,IgG1,IgG2a抗体。HBsAg+yeast免疫小鼠的脾脏细胞不但能够产生较多的IFN-γ和IL-4,而且发生了明显的增殖。脾脏CD4+T,CD8+T细胞均能够产生IFN-γ。HBsAg+yeast既能够诱生Th1方向的免疫应答,也可以增强Th2方向的免疫应答。上述结果说明,HBsAg+yeast在小鼠体内的免疫反应和Yeast-HBsAg相近。提示汉逊酵母细胞可单独发挥Th1型疫苗佐剂作用。综上所述,汉逊酵母细胞作为重组载体或单独的空载体均能够诱导免疫细胞向脾脏聚集,促进DCs的成熟。Yeast-HBsAg和HBsAg+yeast不但能够在小鼠体内诱生Th1方向的免疫应答,而且还能够增强Th2方向的免疫应答。而alum作为HBsAg的佐剂,只能增强Th2方向的免疫反应,不能促进DCs的成熟。因此,基于汉逊酵母细胞的新型乙肝表面抗原疫苗可能在乙肝的预防和治疗中有很大的潜力。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 表达乙肝表面抗原的全汉逊酵母细胞作为新型乙肝疫苗的研究
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 汉逊酵母细胞作为乙肝表面抗原新型免疫佐剂的研究
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 论文总结及创新点
• 文献综述
• 附录
• 致谢