论文摘要
目的:构建人β-神经生长因子基因（β-NGF）的真核细胞表达载体pcDNA3-β-NGF,探讨绿色荧光蛋白（Green flurescent protein,GFP）转基因小鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）体外培养和纯化方法,进一步观察人pcDNA3-β-NGF重组载体在GFP转基因小鼠BMSCs中的表达。 方法:采用RT-PCR方法从人脑肿瘤旁组织的mRNA中扩增人β-NGF的基因片段,将片段和真核表达载体pcDNA3同时经HindⅢ和ApaⅠ双酶切、纯化、连接、转化及筛选,从而构建重组载体pcDNA3-β-NGF。经酶切和测序对重组体进行分析和鉴定。 分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中,分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h和48h进行首次全量换液,在3d按细胞类型对贴壁细胞分别计数并用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。此外,选4h、8h、24h后换液的细胞进行传代培养,在传第5代时,计算扩增倍数,用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。 用已构建的pcDNA3-β-NGF重组载体转染第5代的GFP转基因小鼠BMSCs,经G418筛选,用Western blot和免疫细胞化学染色检
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