论文摘要
水稻是全球最重要的粮食作物之一,世界上半数以上的人以稻米为主要的粮食来源,其中大约90%的水稻被亚洲人生产和使用。水稻纹枯病和稻瘟病是水稻的两大主要病害,水稻纹枯病是由病原菌Rhizoctonia solani引起的,稻瘟病是由病原菌Magnaporthe grisea引起的。Lamp（1994）指出,每年增加的人口至少需要消耗0.13亿吨水稻,相当于全世界在1990到2025年间每年须有1.7%的水稻增产。Baker et al.（1997）研究表明在1975至1990年,因为稻瘟病大约有15.7亿吨水稻损失,几乎相当于全球水稻产量的11%-30%,而源于纹枯病的水稻损失大约在8-50%（Savary and Mew 1996）。因此,培育抗病水稻品种具有重要的现实意义。稻属抗性种质资源的匮乏、生态环境的变化及常规育种方法的局限性给水稻进一步遗传改良带来一定的困难。由于稻瘟菌的致病性分化严重,生理小种多,变化大,水稻自身抗性资源有限,再加上常规育种方法耗时费力,所培育的抗病品种远不能满足生产上的需要。对纹枯病来说,至今还没有发现高抗纹枯病的抗源,缺少抗纹枯病的抗性基因,因而导致水稻的纹枯病抗病育种进展更加缓慢。应用基因工程手段将异源具有广谱抗性的基因转入水稻,获得抗病性增强的转基因植株,实现了传统育种方法无法实现的基因重组分子植物育种,可以大大提高育种水平。本论文首先构建了籼稻缙恢35的农杆菌介导的遗传转化体系,然后利用酵母表达系统表达了来自苜蓿的防御素alfAFP基因,体外研究了表达蛋白对水稻病原菌的抑制影响。考虑到将具有不同功能的抗菌基因一起转入水稻可以提高转基因水稻的持久抗病性,所以构建来自苦瓜的几丁质酶McCHIT1、alfAFP及其双价基因的表达载体,转入水稻,获得转基因植株,并研究了其抗病性和后代农艺性状变化,主要的研究结果如下:一.籼稻农杆菌介导的遗传转化体系的建立1.表达载体的构建构建了McCHIT1、alfAFP单价基因和McCHIT1/alfAFP双价基因的表达载体。该载体包含了除草剂的筛选标记基因和一个GUS基因的报告基因,目的基因以玉米来源的Ubiqutin启动子启动表达。2.缙恢35遗传体系的建立建立了籼稻（缙恢35）的农杆菌介导的遗传转化体系。通过探讨和优化缙恢35的诱导、继代和分化再生的培养基成分、激素配比以及对农杆菌介导的遗传转化所涉及的某些参数,最后确定了缙恢35农杆菌介导的转化程序。获得了大量的再生植株:拟McCHIT1转基因植株495株,拟alfAFP转基因植株620株和拟McCHIT1/alfAFP双价转基因植株285株。3.转基因植株的初步检测通过对转化获得的再生植株进行GUS组织化学检测,结果表明总共有8.64%的阳性植株率。分别获得45株McCHIT1转基因植株、56株alfAFP转基因植株和20株McCHIT1/alfAFP双价转基因植株。通过目的基因的PCR初步检测,GUS阳性植株均扩增出了目的基因片段,说明外源基因已经转入水稻。二.alfAFP基因体外表达蛋白对水稻三大病原菌的抑制作用将alfAFP基因在毕赤酵母中进行分泌表达,其表达产物经过15%SDS-PAGE检测,其分子量大约为6.5 kDa。alfAFP重组蛋白在体外对水稻纹枯病、稻瘟病和白叶枯病菌有一定的抑制效果。在添加alfAFP酵母表达产物22.00μg时对纹枯病有较强的抑菌圈,在含有重组蛋白浓度为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL和20μg/mL的培养基上,50 h内对纹枯病菌丝的生长也有较明显的抑制效果。除此,在添加alfAFP酵母表达产物22.00μg时还分别对稻瘟病和白叶枯病原菌具有一定的抑制作用。三.McCHIT1、alfAFP及其双价转基因水稻的抗病性检测1.转基因水稻T1代分离比检测通过对各转基因植株T1代植株的GUS组织化学检测,GUS基因在T1代分离比例多数符合孟德尔3:1的分离比,表明外源基因多以单拷贝的形式整合转入水稻中。2.各转基因水稻的纹枯病抗性检测各转基因植株多世代（T0、T1和T2代）抗纹枯病检测结果表明,McCHIT1、alfAFP单基因和McCHIT1/alfAFP双价转基因植株均显著提高了对纹枯病的抗性,病情指数较对照植株均下降,其中McCHIT1转基因植株11株,alfAFP转基因植株11株以及McCHIT1/alfAFP双价转基因植株6株。以T2代植株抗性检测为例,各转基因植株病情指数较对照相比下降幅度分别为28.42-42.86、28.24-53.63、25.74-43.96。3.各转基因水稻对稻瘟病的抗性检测各转基因植株多世代（T0、T1和T2代）的稻瘟病检测结果表明,McCHIT1、alfAFP单基因和McCHIT1/alfAFP双价转基因植株均显著提高了对稻瘟病的抗性,病情指数较对照植株均下降,其中McCHIT1转基因植株12株,alfAFP转基因植株11株以及McCHIT1/alfAFP双价转基因植株5株。以T2代植株抗性检测为例,各转基因植株病情指数较对照相比下降幅度分别为31.57-85.73、27.92-57.48、37.81-56.47。此外各转基因植株还表现出对来源不同的多种稻瘟菌的抑制作用。4.转基因水稻抗病性的比较对McCHIT1/alfAFP转基因水稻抗病性比较分析,结果表明,McCHIT1基因在提高转基因水稻对纹枯病的抗性方面表现相对好一些,而alfAFP基因在提高转基因水稻对稻瘟病的抗性方面表现相对好一些。McCHIT1/alfAFP双价转基因植株虽然一定程度提高了对纹枯病和稻瘟病的抗性,但是没有发现两个基因明显的协同增强作用。5.转基因表达水平对抗病性的影响通过RT-PCR分析了目的基因在转基因水稻中的表达水平,并评价了和抗性水平之间的关系。实验结果表明,McCHIT1和alfAFP基因在转基因植株中的转录水平上均得到有效表达,并且不同的转基因植株的表达水平有所差异。在双价转基因植株中,两个基因的表达水平表现不一致。在一定条件下,具有更高水平的目的基因表达植株通常具有更高的抗病水平,但也有极少数转基因植株虽然具有较高目的基因的表达水平却没有表现出相应的抗病水平。四.转基因植株后代主要农艺性状分析分析所有测试转基因植株T2代的8个主要农艺性状,结果显示,与对照植株相比,大多数转基因植株后代的8个农艺性状均有不同程度的变异,总体上在T2代出现了植株矮小或者明显高大,育性降低,分蘖力降低,穗长、穗粒数、千粒重明显下降等变异。且某些测试的转基因植株在某些性状表现更优良。1.McCHIT1转基因植株的农艺性状分析调查的8个主要农艺性状测定结果表明,株系间各农艺性状存在一定程度的差异。在各转基因株系中,株高、有效穗、穗长、单穗总粒数、结实率、千粒重、单穗实粒重和单株实粒重的变异幅度分别为76.2-125.9 cm、4.6-20.2穗、24.8-29.4cm、184.0-294.5粒、14.3-82.6%、26.3-39.7 g、0.7-6.6 g和6.9-83.8 g。2.alfAFP转基因植株的农艺性状分析调查的8个主要农艺性状测定结果表明,株系间各农艺性状存在一定程度的差异。在各转基因株系中,株高、有效穗、穗长、单穗总粒数、结实率、千粒重、单穗实粒重和单株实粒重的变异幅度分别为88.1-115.0 cm、6.6-13.6穗、25.9-27.6cm、162.4-219.8粒、52.7-87.1%、26.1-35.7 g、3.0-5.1 g和20.9-68.8 g。3.McCHIT1/alfAFP转基因植株的农艺性状分析调查的8个主要农艺性状测定结果表明,株系间各农艺性状存在一定程度的差异。在各转基因株系中,株高、有效穗、穗长、单穗总粒数、结实率、千粒重、单穗实粒重和单株实粒重的变异幅度分别为78.3-111.0 cm、5.4-13.4穗、23.6-26.7cm、155.1-219.5粒、37.6-79.3%、25.6-31.8 g、1.8-4.8 g和20.6-55.1 g。4.各转基因植株农艺性状的变异系数与相关性在不同基因的转基因植株中,株高、穗长、每穗总粒数和千粒重性状变异系数较小,而有效穗、结实率、穗实粒重和株实粒重性状的变异系数较大。与单株实粒重成显著正相关的性状在不同基因的转基因植株中存在一定差异,且具有不同大小的相关系数。某些具有负相关的性状在不同基因的转基因植株中也具有一定的差异。