HrpN基因在毕赤酵母中的克隆表达与活性检测

论文摘要

以harpinEa蛋白编码基因hrpN的开放阅读框（ORF）为模板,根据毕赤酵母表达载体pPIC6αA的特点设计hrpN片段引物,从含有hrpN基因的pET-hrpN质粒上PCR扩增出hrpN基因。克隆到pUCm-T载体中,并测序。用限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ酶切重组载体pUCm-T-hrpN,得到hrp基因片段,将此片段克隆到毕赤酵母表达载体pPIC6αA上,并置于醇氧化酶（AOX1）启动子和分泌信号因子下游,构建重组表达载体pPIC6αA-hrpN。再用SacⅠ酶线性化,将线性化重组表达质粒pPIC6αA-hrpN经电击转化到毕赤酵母菌株X-33中,用抗生素Blasticidin进行抗性筛选,再经PCR鉴定,获得稳定分泌表达harpinEa蛋白的重组毕赤酵母菌株。甲醇诱导表达,浓缩表达上清,镍柱纯化,SDS-PAGE电泳分析。结果显示,诱导表达96h的毕赤酵母X-33（pPIC6αA-hrpN）明显分泌与harpinEa蛋白大小一致的蛋白。该蛋白的生物活性测定结果表明,表达产物具有诱导烟草超敏感反应的功能。

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HroN基因在毕赤酵母中的克隆表达与活性检测

前言

1 Harpin蛋白的研究概况

2 毕赤酵母表达系统

3 本研究的目的和意义

实验材料

1 载体与菌种

2 酶与试剂

3 引物合成

4 培养基及溶液的配制

实验方法

1 目的片段的PCR扩增及其T-clone载体的构建

2 重组质粒pPIC6αA-hrpN的构建

3 重组表达质粒转化Pichia pastoris X-33

4 重组酵母菌X-33（pPIC6αA-hrpN）的筛选与鉴定

5 筛选重组子

Ea在酵母中的诱导表达'>6 Harpin_Ea在酵母中的诱导表达

Ea的检测'>7 重组酵母表达产物harpin_Ea的检测

8 进一步筛选高表达重组菌

9 诱导条件的摸索

10 表达产物的纯化

11 表达产物的活性测定

实验结果

1 目的片段的PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定

2 重组表达菌株的鉴定

3 高表达酵母工程菌株的筛选以及酵母工程菌的表达和检测

4 表达产物的纯化

5 表达产物活性测定结果

讨论

1 目的基因的选择

2 表达系统的选择

3 hrpN序列的引物设计和PCR扩增

4 酵母分泌信号肽的应用及影响

5 His尾巴的应用

6 转化子的表型及产生

7 酵母工程菌的筛选

Ea在毕赤酵母中的诱导表达'>8 Harpin_Ea在毕赤酵母中的诱导表达

9 糖基化问题

Ea在酵母中表达的影响因素'>10 Harpin_Ea在酵母中表达的影响因素

小结

参考文献

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