胰岛素受体亲合短肽的筛选、合成及量子点荧光标记的研究

论文题目: 胰岛素受体亲合短肽的筛选、合成及量子点荧光标记的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 细胞生物学

作者: 王会堂

导师: 李玉新

关键词: 胰岛素,胰岛素受体,配体筛选,肽库,量子点

文献来源: 东北师范大学

发表年度: 2005

论文摘要: 胰岛素是胰岛β细胞分泌的一种蛋白质激素,其主要功能是通过调节外周组织的葡萄糖摄取和代谢,及肝糖元的产生和储存来维持体内葡萄糖的平衡。胰岛素复杂的生物功能是通过它与受体的结合而实现的。胰岛素受体(IR)是一个跨膜糖蛋白,由两个分子量为 135 KD 的α亚基和两个分子量为 95KD 的β亚基通过二硫键连接而成β-α-α-β结构。α亚基位于胞外,与配体结合有关。多年来,对胰岛素与其受体结合机制不断被修正。现在普遍认为,胰岛素分子具有两个受体结合部位,与此相应,胰岛素—受体复合物晶体结构显示,胰岛素受体的两个α亚基提供两个不同的结合位点,胰岛素以疏水氨基酸与其中一个位点的疏水部分作用,而与另一受体单体之间的作用主要依靠静电力作用而没有明显的疏水部分存在。β亚基是跨膜蛋白质,其胞内部分在胰岛素受体信号传递中发挥重要作用。胰岛素与其受体结合后引起受体自身磷酸化,从而使其酪氨酸蛋白激酶活化,随后受体与其底物即胞内信号蛋白(IRS-1、IRS-2 等)发生相互作用。使底物分子的某个酪氨酸残基发生磷酸化,底物分子发生磷酸化后再与 SH2蛋白(如 PI3’激酶)发生结合,将信号传递下去。尽管对于受体的激活方式和信号传递途径已经有所了解,但关于胰岛素结合位点的分子结构,胰岛素结合的完整位点以及胰岛素引发生物活性的信号机制等信息还并未完全明确。多年来人们一直致力于研究胰岛素受体的热点部位,以及胰岛素结合部位,希望能解决这些问题,并希望得到最小的但能与胰岛素有高亲和力的重组胰岛素受体片段。胰岛素分子经口服会在体内分解,鼻腔黏膜给药生物利用度低、且对鼻黏膜的破坏严重,糖尿病患者的给药途径主要是静脉注射,而注射的高于生理浓度的胰岛素分子又有自身聚合效应,阻碍了药物发挥作用。寻找和设计天然胰岛素的小分子类似物,制备口服药物将具有很重大的现实意义。利用噬菌体随机展示肽库进行筛选是一个很好的方法。本研究以高效表达胰岛素受体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为筛选靶,利用噬菌体随机展示六肽库筛选胰岛素受体亲和短肽。经四轮筛选,得到六个 ELISA 阳性重组克隆,测定其 Kd 值均为纳摩尔级(5.911nM～26.899nM)。Kd 值作为筛选成功的主要指标能更真实反映筛选效果。经测序得到六个肽序列,比较发现明显的保守序列存在。通过肽自动合成仪和手工合成其中五个小肽,又以肽偶联方式将生物素连接在短肽 N-末端,得到小肽的生物素化和形式。以质谱和 ELISA 方法从结构和生物活性两方面证明以此方法连接的生物素不影响其与亲合素的结合活性。此方法简化了常规使用NHS-biotin 进行短肽生物素化后的繁杂纯化过程,而且大大降低了原料花费。ELISA 方法测定并利用PRISM 4.0软件计算了这五个小肽与CHO-IR的Kd值,在5.870μM~128.6μM 之间,属于特异性结合范围。比较其与噬菌体展示短肽与 CHO-IR 的 Kd 值的差异,在 102-104 之间。因为在肽库的筛选和检测中所用的单抗—多抗系统经历了两步信号放大,而且噬菌体展示表位肽附近的氨基酸在空间上可能对结合有贡献,由此产生了这种差异。这一比较结果可以为以后肽库筛选的取舍提供参考。为了解各基序在小肽与胰岛素受体结合中所起到的作用,用竞争 ELISA 测定混合小肽与 CHO-IR 结合的互相影响,其中一种小肽用其生物素化形式,同时加入竞争肽,以酶标亲合素检测。发现具有 T/S~V~的两个小肽显示出相互抑制作用,且两者的 Kd值都是强特异性,推测这个基序对于小肽与 CHO-IR 微摩尔级结合起到了较大作用,而T~V,LG/AP 两个基序可能在一定距离上有互补结合作用。胰岛素能够在 nM～pM 范围内达到促大鼠脂肪细胞吸收葡萄糖作用的饱和值,以胰岛素作用的最大值为 100%,测定各小肽对脂肪细胞摄入葡萄糖的影响。各小肽在较低浓度时作用不明显,在 mM 浓度小肽 3、8、10 表现了明显抑制作用,而小肽 1、2 表现了部分激动活性。如果考虑优化小肽,使其在较低浓度下呈现激动活性,可以从小肽1、2 序列入手。这部分工作对于研究开发类胰岛素小肽药物及识别胰岛素受体表面的结合热点具有很大意义。发光量子点(luminescent quantum dot)又可称为半导体纳米微晶体(semiconductornanocrystal),是近几年发展起来的新材料,是由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的纳米颗粒。作为荧光探针,量子点越来越显示出它能够替代传统的有机染料优越性。量子点具有狭窄对称的荧光谱峰(通常 20nm~30nm)。而且可以根据量子点的大小和组成材料调整它的发射光谱,以 CdTe 纳米晶体合成为例,当它的微粒尺寸(直径)从 2.5nm 生长到 4.0 nm 时,它们的光谱即可以从 520nm 调整到 650nm。量子点具有宽泛的吸收光谱,这样就能用同一光谱同时激发所有颜色的 QDs。此外,量子点的荧光信号强而稳定,不易被光漂白,不影响生物分子(抗体、蛋白、细胞)的生物活性。以上种种都使量子点成为一种新型的潜力巨大的荧光探针,应用于生物医学领域,尤其用于蛋白示踪、细胞成像。以量子点(QDs)为标记物标记阳性噬菌体克隆,在荧光显微镜下可以看到,通过受体-配体作用 QDs 特异性地标记了 CHO-IR 细胞。验证了噬菌体经 QDs 标记后不影响其侵染活性,标记 5 个月后的荧光强度仍清晰可见。此外通过 avitin-biotin 将 QDs

论文目录:

中文摘要

英文摘要

主要英文缩写词表

提要

第一章前言

一、胰岛素及胰岛素受体

二、噬菌体表面展示肽库技术

三、半导体量子点

第二章材料与方法

一、材料、试剂和仪器

二、实验方法

第三章结果与讨论

一、噬菌体展示肽库筛选

（一）噬菌体展示肽库亲和筛选

（二）阳性重组噬菌体克隆的KD值测定

二、亲和短肽的氨基酸序列分析

三、肽的合成

（一）肽2 KSTIVY 的合成

（二）肽1 DLAPSQ,肽3 VWTLGP,肽8 TRYWVN,肽10 WSRVRS 的合成

四、ELISA 方法测定胰岛素及合成肽CHO-IR 的结合活性

（一）胰岛素与CHO-IR 的Kd 值测定

（二）小肽与CHO-IR的Kd值测定

（三）测定小肽之间的相互作用及对结合的影响

五、小肽对大鼠脂肪细胞收葡萄糖影响活性测定

六、量子点荧光标记分析

（一） QDs 标记的噬菌体展示小肽与胰岛素受体的结合

（二） QDs标记对重组噬菌体侵染活性的影响

（三）通过QDs-avidin 标记的小肽与胰岛素受体的结合

总结

参考文献

致谢

作者简介

发布时间: 2005-07-07

参考文献

[1].肠溶包衣胰岛素—壳聚糖复合物纳米粒的研究[D]. 张立强.沈阳药科大学2005

胰岛素受体亲合短肽的筛选、合成及量子点荧光标记的研究

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