论文摘要
一研究背景MicroRNAs （miRNAs）具有广泛的基因调节功能,涉及生命过程中包括早期胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、甚至干细胞分化等一系列重要进程,与生命体正常生理功能调控以及疾病的发生有着密切的关系。近年来随着miRNAs在循环系统中被检测出来,循环miRNAs在临床疾病诊断及药物治疗等方面的作用逐渐被关注。厄贝沙坦属血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）,作为稳定有效的降压药在高血压治疗中得到广泛应用。目前ARB类降压药对人血浆miRNAs表达影响的研究未见报道。二研究目的1.建立人血浆miRNAs提取及定量检测方法；选择适用于心血管疾病研究血浆miRNAs相对定量检测的内参；验证长期冻存人血浆miRNAs的稳定性。2.分析连续口服厄贝沙坦前后健康人血浆miRNA表达谱,筛选出药后表达差异的miRNAs。3.验证药后健康人血浆表达差异的miRNAs并分析其与药物的关系。4.为寻找监测ARB类降压药治疗效果的新生物标记物探索新的研究方向。三研究内容及方法1.应用mirVana PARIS Kit （AM1556）提取试剂盒进行血浆miRNAs提取,定量检测采用TaqMan MicroRNA Assays qRT-PCR,优化实验方法,建立适用于本研究的提取检测方法；同时通过比较健康人及心血管病人血浆候选内参miRNAs表达稳定性对心血管病相关研究中人血浆miRNAs定量检测的内参进行评价,并从多方面验证人血浆miRNAs表达的稳定性。2.16名健康男性汉族受试者分为两组,每日口服厄贝沙坦150mg,连续7天,评价指标包括：临床观察和药代动力学参数。同时应用TaqMan Low-Density Arrays （TLDA）分析8名受试者血浆miRNA表达谱,并结合生物信息学miRNA功能性分析筛选表达差异的候选miRNAs。3.应用TaqMan MicroRNA Assays qRT-PCR方法验证另外8名受试者血浆中差异miRNAs表达水平,并分析差异miRNAs与药物降压效果及药代动力学参数的关系。4.应用SPSS13.0软件进行统计学分析,组间差异检验采用Wilcoxon test及Mann-Whitney test方法,相关性分析采用bivariate相关分析,双侧检验,p<0.05认为具有统计学差异。四研究结果1.本研究通过优化实验方法建立了稳定可靠的血浆miRNAs提取和定量检测方法,并验证了健康人血浆miRNAs表达的稳定性。本研究证实候选内参（U6,miR-16）在健康人和心血管病人血浆中表达无明显差别。冻存2年内血浆及提取后2周的血浆RNA仍可进行准确的miRNAs相对定量检测。2.健康人服用厄贝沙坦后血浆miRNA表达谱发生改变,其中26个miRNAs表达显著上调,4个显著下调；生物信息学功能分析确定14个可能与药物作用相关的候选差异miRNAs。3.验证14个差异表达候选miRNAs中6个表达水平上调,6个表达水平下调,2个无变化；其中血浆has-miR-25表达水平显著上调2.36倍（P<0.05）,同时has-miR-323-3p显著下调2.02倍（P<0.05）且与药后舒张压下降相关；药后表达差异的miRNAs与药物代谢及药物分布相关基因调控无关。五研究结论1.U6和miR-16均适合做为人体血浆miRNA定量分析的内参。2.低温条件下血浆储存2年内miRNAs稳定存在。3.连续服用厄贝沙坦可使健康人血浆miRNA表达谱发生改变,且表达上调的miR-25和下调的miR-323-3p变化具统计学意义。其中miR-323-3p表达下调与药物引起的舒张压下降相关。4.本研究结果还需扩大样本量进一步验证。