论文摘要
鱼类是低等的脊椎动物,以血清免疫球蛋白为中心的系统免疫（systematic immunity）尚不完善,但是以粘膜免疫系统为基础的粘液性免疫却很发达。由肠道、皮肤和鳃及其表面的粘液组成的粘膜免疫系统是抵御病原入侵的第一道屏障,在鱼类免疫中起重要作用,已成为鱼类免疫学研究的一个热点领域,引起人们的广泛关注。本文以我国主要名优淡水鱼类黄鳝作为实验材料,对其消化道、皮肤等粘膜相关淋巴组织的构成、粘液中的免疫球蛋白及Ig阳性细胞在粘膜相关淋巴组织当中的分布进行研究,以期为进一步研究黄鳝的粘膜免疫机制奠定基础。利用组织化学技术对黄鳝皮肤、咽、食道、胃及前中后肠粘膜组织的显微结构、主要免疫相关细胞的分布进行研究。结果表明咽、食道、胃部存在少量的淋巴细胞;皮肤和肠道中分布着丰富的淋巴细胞,其中背部皮肤的淋巴细胞远远多于腹部;肠道中的IELs比LPLs多,而前中后肠的淋巴细胞数量没有明显区别。由于前肠时常有寄生虫的感染,其嗜曙红粒细胞在固有层有大量分布,数量比中后肠多。对粘膜相关淋巴组织的组织切片进行阿新蓝-过碘酸雪夫氏试剂（AB-PAS）染色,观察黄鳝粘膜相关组织粘液细胞的形态和类型。结果表明,黄鳝皮肤和消化道中存在丰富的粘液细胞,可分成三型:Ⅰ型为蓝色,AB阳性,PAS阴性,含酸性粘多糖;Ⅱ型为紫红色,AB与PAS均为阳性,同时含有中性粘多糖和酸性粘多糖,但以中性粘多糖为主;Ⅲ型为蓝紫色,AB与PAS均为阳性,同时含中性粘多糖和酸性粘多糖,但以酸性粘多糖为主。黄鳝皮肤中的粘液细胞均属于Ⅰ型,即含酸性粘多糖;咽部和食道同时存在ⅠⅡⅢ型粘液细胞,其中咽部的大部分为Ⅲ型粘液细胞,而食道的大部分为Ⅰ型粘液细胞,两者的Ⅱ型粘液细胞数量均很少;肠道中的粘液细胞均为Ⅲ型。采用Hitrap protein A HP亲和层析法成功从黄鳝血清中纯化得到IgM,其重链分子量为72kDa,轻链为2条,分子量分别为28kDa和25.3kDa。从黄鳝皮肤粘液和肠粘液中得到Protein A特异性结合的蛋白,结果显示两者的电泳图谱在重链区有两条明显的蛋白条带,其中一条蛋白带与血清Ig的重链分子量一致;在轻链区也有相应的蛋白带,因此从肠粘液和皮肤粘液分离得到的Protein A结合蛋白中存在IgM。用纯化的黄鳝血清IgM作为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,免疫双扩散法测定多抗效价为1:32;同时,皮肤粘液和肠粘液IgM与此多抗均有免疫沉淀反应。Western-blotting显示该多克隆抗体与血清Ig、皮肤粘液IgM及肠粘液IgM的重链均能特异性结合。通过免疫组织化学原位显示黄鳝IgM阳性细胞在粘膜相关淋巴组织中的分布。结果表明黄鳝皮肤、胃部和整个肠道均有IgM阳性细胞的存在。其中,皮肤的IgM阳性细胞数量较少,主要分布在表皮的基底部,IgM阳性细胞在胃底部的分布很少,主要存在于胃腺的上皮细胞间。整个肠道分布着许多IgM阳性细胞,上皮内IgM阳性细胞远远多于固有层的IgM阳性细胞。通过普通组化比较显示上皮内IgM阴性淋巴细胞的数量要比IgM阳性细胞多。本实验通过对黄鳝粘膜相关淋巴组织的基本结构、各种免疫细胞及粘液细胞分布的研究,证实了黄鳝的粘膜相关淋巴组织当中存在着大量的淋巴细胞及其它免疫相关细胞,并分布有抗体分泌细胞,认为黄鳝具有不依赖于系统免疫能够独立完成特异性免疫应答的细胞基础。通过对黄鳝粘膜免疫系统展开研究,丰富了鱼类免疫学知识,为进一步研究黄鳝的局部特异性免疫机制奠定基础,并为浸泡疫苗和口服疫苗的研制和开发提供基础资料,从而能够进一步扩大黄鳝以及其它鱼类的规模化养殖。