论文题目: 5’CpG岛甲基化检测基因芯片的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 动物遗传育种与繁殖
作者: 周东蕊
导师: 杨利国,陆祖宏
关键词: 甲基化,基因芯片,双色荧光杂交,抑制性差减杂交技术
文献来源: 南京农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 哺乳动物DNA甲基化主要指CpG岛的甲基化修饰，是一种重要的表观遗传模式，与基因激活、基因印记、细胞分化与发育、以及衰老和癌变等一系列生命过程密切相关，是当今分子生物学领域研究热点。虽然CpG岛甲基化的分析方法发展较为迅速，但因目前缺乏有效的高通量甲基化分析方法，以致严重阻碍了这些生命活动调控规律的研究。基因芯片是近十几年来发展极快的一项技术平台，具有高通量、高灵敏度、快速自动等显著的特点，目前已应用于基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析等多项分子研究领域，CpG岛甲基化检测芯片也有所发展，但速度缓慢。针对这一需要，本论文发展了三种类型甲基化检测芯片，为实现更高通量甲基化分析芯片的制备，还对CpG岛数据库的构建做了大胆探索。具体内容如下： (1)IGFBP7基因甲基化谱寡核苷酸芯片分析技术研究 IGFBP7是一种胰岛素样生长因子结合蛋白编码基因，这种蛋白能够通过与IGF-2结合来调节细胞生长和抑制有丝分裂活性，对于卵泡发育及胚胎的生长发育都具有重要的调控作用，而且也是一种重要的肿瘤抑制基因。本研究的目的旨在开发一种用于IGFBP7基因甲基化谱分析的寡核苷酸芯片。该方法的步骤为：提取正常人血液和人类乳腺癌组织样本基因组DNA，进行亚硫酸氢盐修饰，修饰过后的基因组DNA中甲基化的胞嘧啶保持不变，而未发生甲基化的胞嘧啶则转变为尿嘧啶，以修饰后的DNA为模板进行PCR扩增，扩增引物为测序引物，也就是将引物设计在不含有CpG二核苷酸的位点上，结果导致所扩增区域未甲基化胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而甲基化的位则不发生变化。其中以正常人血液基因组DNA为阴性对照样本，而M.SssⅠ处理的(这种酶的处理可以导致所有基因组中CpG二核苷酸中的胞嘧啶都发生甲基化)正常人血液基因组DNA为阳性对照。对于肿瘤样本，由于各个片断甲基化的状态不同，扩增的PCR产物就可能是各种甲基化状态的一种混合物。本研究针对PCR产物中18个CpG位点设计了6对寡核苷酸探针，每对探针包含2-4个CpG二核苷酸位点，其中一条探针与甲基化的靶序列的相匹配，另一条探针与未甲基化的靶序列相匹配。将探针固定在处理后的DAKO玻片上，然后与cY3标记后的PCR产物杂交，激光扫描仪扫描并分析杂交结果。采用阳性克隆PCR产物与阴性克隆PCR产物参比建立定量检测曲线。参比实验发现，对于每对探针，PCR产物甲基化水平与荧光信号强度比值M／(M+u)有良好的线性相关性．本研究共检测了15对乳腺癌组织IGFBP7基因甲基化谱，发现所有样本中的所有位点甲基化程度都在
论文目录:
中文摘要
英文摘要
引言
文献综述 哺乳动物DNA甲基化及其检测方法研究进展
一、概述
(一) CpG岛
(二) DNA甲基化的代谢
(三) 原核生物DNA甲基化生物学意义
二、DNA甲基化与胚胎生长发育和组织分化
(一) DNA甲基化调控基因表达机制研究
(二) DNA甲基化与基因组印迹
(三) DNA甲基化与X染色体失活
(四) DNA甲基化与胚胎克隆
(五) DNA甲基化与机体免疫力
(六) 异常甲基化与肿瘤发生
三、甲基化检测方法
(一) 甲基化检测方法的基本原理
(二) 甲基化检测方法
1、常规方法
2、特定片段甲基化分析方法
3、多序列甲基化分析方法
四、基因芯片技术及其在DNA甲基化检测中的应用
(一) 基因芯片技术工作原理
1、基因芯片的制备
2、样品制备、杂交和检测
(二) 基因芯片应用前景
(三) 检测甲基化的基因芯片技术
(四) 展望
参考文献
第二篇 实验研究
一、分析IGFBP7基因甲基化的寡核苷酸芯片技术研究
1 引言
2 材料与方法
2.1 标本来源
2.2 基因组DNA抽提
2.3 M.Sss Ⅰ酶处理血液基因组DNA和基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰
2.4 PCR扩增与阴性克隆和阳性克隆的制备
2.5 寡聚核苷酸微阵列的制备
2.6 杂交
2.7 图像扫描与数据处理
2.8 测序
3 结果
3.1 MSO检测原理分析
3.2 定量曲线的绘制
3.3 乳腺组织样本的检测
3.4 测序法验证芯片测定结果的准确性
4 讨论
参考文献
二、DNA甲基化分析的双色荧光杂交微阵列方法研究
1.引言
2.材料与方法
2.1 样本
2.2 基因组DNA亚硫酸氢盐转化
2.3 PCR扩增
2.4 对照样本克隆与测序
2.5 芯片制备
2.6 探针合成
2.7 杂交
2.8 图像扫描与数据处理
2.9 PCR产物测序
3.结果
3.1 检测原理
3.2 定量分析
3.3 甲基化水平测定标准曲线建立
3.4 样本甲基化水平测定
3.5 样本测序法验证芯片杂交结果的准确性
4.讨论
参考文献
三、亚硫酸氢盐修饰靶DNA芯片甲基化分析方法研究
1 引言
2.材料与方法
2.1 实验样本
2.2 亚硫酸氢盐修饰与PCR扩增
2.3 PCR产物点样
2.4 探针1
2.5 杂交与信号检测
2.6 亚硫酸氢盐测序
2.7 亚硫酸氢盐基因组DNA阵列制备
2.8 杂交信号量化与结果统计
3.结果
3.1 检测原理
3.2 PCR产物阵列分析IGFBP7基因CpG岛甲基化
3.3 PCR产物芯片灵敏度检测
3.4 亚硫酸氢盐转化的基因组芯片检测进行甲基化分析
4.讨论
参考文献
四、构建CpG岛文库的抑制性差减杂交技术研究
1 引言
2 材料与方法
2.1 样本基因组DNA的抽提及M.Sss Ⅰ酶处理
2.2 采用Mse Ⅰ进行gDNA的酶切
2.3 Driver的制备
2.3.1 Linker连接
2.3.2 甲基化敏感性内切酶HapⅡ消化
2.3.3 Linker-PCR扩增
2.4 抑制性差减杂交
2.4.1 接头连接及HapⅡ消化
2.4.2 第一次杂交
2.4.3 第二次杂交
2.4.4 差减产物的PCR扩增
2.5 差减片段的克隆
2.6 挑取克隆PCR扩增分析和测序分析
2.7 结果统计分析
2 结果
3 讨论
参考文献
创新
攻读博士期间文章发表
致谢
发布时间: 2006-10-20
参考文献
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