海底沉积物微生物燃料电池模型的建立及一株海洋细菌新种的分类鉴定

论文摘要

海底沉积物微生物燃料电池（Benthic microbial fuel cell, BMFC）是以海底沉积物中的有机物质为燃料,以石墨电极或铂电极和金属导线等为媒介,利用附着在阳极表面的微生物将生物能转化为电能的装置。BMFC的阳极埋在厌氧的海底沉积物中,阴极暴露在含有溶解氧的海水中并通过外电路与阳极相连。BMFC具有免维护、连续供应、底物丰富、内阻低、环境友好等优点,非常有希望作为一种能源装置用于驱动在偏远海域工作的低功率监测仪器。然而,现有的BMFC的产电效率和稳定性不高,因此至今尚未实现规模化应用。研究表明,BMFC的产电效率与阳极表面产电细菌及其周围细菌群落的组成有直接关系。为了提高BMFC的运行效率,本论文在实验室构建了BMFC模型,研究了其阳极表面细菌的分布特征,并初步探索了海洋细菌对BMFC表面细菌群落和产电效能的影响;同时对从其阳极表面分离的一株海洋细菌新种进行了分类鉴定。本论文首先在实验室建立了BMFC模型,从阳极表面分离并测序了52株异养细菌,分别属于变形菌门（Proteobacteria,10株）、厚壁菌门（Firmicutes,40株）和拟杆菌门（Bacteroidetes,2株）三大门类。厚壁菌门的细菌占总菌数的77%,其中芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌占到了总菌数的61.5%。在32株芽孢杆菌中,蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）有8株。芽孢杆菌是该微生物燃料电池阳极表面异养细菌群落的优势菌群,蜡样芽孢杆菌是优势菌种。从BMFC阳极表面分离得到一株潜在的海洋细菌新种LYX05,其16S rDNA测序结果与NCBI中的已知序列比对发现,其最大相似度是95.8%（Algoriphagus maincola）,并对其进行了生理生化等方面的鉴定。生理生化特征显示该菌的细胞提取物在482nm的波长处有一个吸收峰值,LYX05不能利用苦杏仁苷、水杨苷和D-松三糖产酸,不能利用碳源D-果糖、D-乳糖、D-麦芽糖和D-甘露糖。脂肪酸含量中占显著地位的是iso-C15:0 （40.82%）。DNA的G+C含量为42.5 mol%。根据表型特征、生理生化特征及系统发育特征鉴定得出,菌株LYX05T是Algoriphagus属的一个新种,因其分离自海洋沉积物底泥,因此命名为海洋底泥食冷菌（Algoriphagus faecimaris）,菌株LYX05T （=JCM 16561T =DSM 23095T=LMG 25474T）是该种的标准菌株。通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）微生物指纹图谱技术结合16S rDNA序列分析发现,沉积物和阳极表面的细菌群落存在很大差异,阳极表面细菌群落更具多样性,且均检测到与产电有关的地杆菌。分别将蜡样芽孢杆菌LYX03（HQ202561）、海洋新菌海洋底泥食冷菌LYX05的菌液以及LYX03的DNA,添加到运行稳定的BMFC阳极表面,研究它们对BMFC产电效能以及其阳极表面细菌群落组成的影响。添加海洋底泥食冷菌的实验组输出电压大大降低,降至原输出电压的20%左右。根据DGGE条带分析比较,推测玫瑰杆菌（Roseobacter sp.）可能与输出电压下降有关。向阳极表面添加蜡样芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌DNA,对产电效能和细菌群落的影响不明显。同时进一步研究了外源性碳源的输入（葡萄糖和LB培养基）对BMFC产电效能以及阳极表面细菌群落组成的影响。LB培养基的加入导致输出电压显著下降,降至原输出电压的40%左右,推测LB培养基的加入对好氧细菌的生长有促进作用,从而产生对产电细菌的竞争性抑制。外源性碳源葡萄糖的加入对阳极表面细菌群落的组成和输出电压没有产生较大影响。另外,发现阳极表面的华丽杆菌（Chryseobacterium sp.）最易受到外源性细菌和碳源的干扰,但电压输出相关性不大。阳极表面微生物种类的演化影响电池产电的稳定性,而且阳极表面细菌的种类可能受到沉积物中有机物含量和成份的制约,从而影响产电效能。因此研究阳极表面细菌群落的组成以及产电细菌跟其他细菌相互作用的关系对保障BMFC高效稳定运行有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 微生物燃料电池研究概况
• 1.1 微生物燃料电池及其发展
• 1.2 微生物燃料电池阳极电子传递机制
• 1.3 微生物燃料电池的应用
• 1.3.1 废水处理
• 1.3.2 生物修复
• 1.3.3 生物传感器
• 1.4 海底沉积物微生物燃料电池
• 2 微生物燃料电池的产电细菌
• 2.1 产电细菌的种类多样性
• 2.2 主要产电细菌的模式种类
• 2.3 产电细菌菌群的调控
• 3 海底沉积物微生物燃料电池菌群的分析方法
• 3.1 细菌计数方法
• 3.1.1 培养计数法-平板涂布计数法
• 3.1.2 荧光显微镜计数法
• 3.2 细菌种类分析方法
• 3.3 海洋新菌分类与鉴定技术
• 3.3.1 表型特征分类鉴定
• 3.3.2 基因型特征分析
• 4 本论文的研究目的和意义
• 第二章 海底沉积物微生物燃料电池阳极表面细菌的分布特征
• 1 前言
• 2 实验材料和仪器
• 2.1 培养基
• 2.2 实验仪器
• 3 实验方法
• 3.1 BMFC 的实验室模型
• 3.2 样品采集
• 3.3 荧光显微镜直接计数
• 3.4 平板计数及分离培养
• 3.5 菌种的保藏
• 3.6 16S rDNA 序列分析
• 3.6.1 酚-氯仿法提取细菌基因组DNA
• 3.6.2 16S rDNA 片段的扩增
• 3.6.3 扩增产物的检测及纯化
• 3.6.4 序列比对及系统树的构建
• 4 结果与讨论
• 4.1 样品细菌计数
• 4.2 分离纯化的细菌DNA 的抽提及16S rDNA 的PCR 扩增
• 4.3 菌株测序及系统发育进化树的构建
• 第三章 海洋细菌对海底沉积物微生物燃料电池阳极表面细菌群落和产电效能影响的初步研究
• 1 前言
• 2. 材料仪器和试剂
• 2.1 使用仪器
• 2.2 试剂
• 3 实验方法
• 3.1 海底沉积物微生物燃料电池系统的设置
• 3.2 记录输出电压
• 3.3 阳极微生物膜样品采集
• 3.4 样品中细菌总DNA 的提取
• 3.5 16S rDNA 的PCR 扩增
• 3.6 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 3.7 切胶测序
• 4 结果
• 4.1 不同添加物对海底沉积物微生物燃料电池输出电压的影响
• 4.2 阳极表面微生物膜细菌群落的分析
• 4.2.1 细菌总DNA 的提取
• 4.2.2 PCR-DGGE
• 5 讨论
• 第四章 海洋新菌-海洋底泥食冷菌（Algoriphagus faecimaris）的分类鉴定
• 1 前言
• 2 实验材料和实验仪器
• 2.1 实验试剂和培养基
• 2.2 实验仪器
• 2.3 其他试剂
• 3 实验方法
• 3.1 实验菌株来源和参考菌株
• T'>3.1.1 待测菌株LYX05^T
• 3.1.2 参考菌株
• 3.2 实验菌株16S rRNA 基因的鉴定
• 3.3 实验菌株表型特征鉴定
• 3.3.1 菌落及细胞形态特征观察
• 3.3.2 革兰氏染色
• 3.3.3 鞭毛染色实验
• 3.4 实验菌株经典生理生化鉴定
• 3.4.1 温度实验
• 3.4.2 耐盐实验
• 3.4.3 pH 耐受范围
• 3.4.4 厌氧实验
• 3.4.5 过氧化氢酶实验
• 3.4.6 淀粉酶实验
• 3.4.7 明胶酶实验
• 3.4.8 脂酶实验
• 3.4.9 酪蛋白酶实验
• 3.4.10 DNA 酶试验
• 3.4.11 抗生素敏感性实验
• 3.5 API 20E 快速鉴定
• 3.6 API 20NE 快速鉴定
• 3.7 API 50CH 产酸鉴定
• 3.8 API ZYM 鉴定
• 3.9 BIOLOG 鉴定
• 3.10 脂肪酸含量分析
• 3.11 G+C 含量测定
• 4 结果及分析
• T 菌落形态及菌体形态'>4.1 LYX05^T菌落形态及菌体形态
• T 生理生化特征'>4.2 LYX05^T生理生化特征
• T G+C 的mol%含量'>4.3 LYX05^T G+C 的mol%含量
• T 脂肪酸含量'>4.4 LYX05^T脂肪酸含量
• T 醌的测定'>4.5 LYX05^T醌的测定
• 4.6 16S rDNA 测序结果及分析
• T 分类地位'>5 LYX05^T分类地位
• 论文总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文