侵染花生的Cucumoviruses病毒基因组全序列分析和转基因抗性研究

论文题目: 侵染花生的Cucumoviruses病毒基因组全序列分析和转基因抗性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理

作者: 晏立英

导师: 许泽永

关键词: 花生,病毒基因组,序列分析,转基因抗性

文献来源: 中国农业科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 为了在核酸水平上了解我国侵染花生的两种Cucumoviruses病毒的遗传、变异和进化,本文完成了我国花生矮化病毒-轻型株系(Peanut stunt viru mild strain,PSV-Mi)、黄瓜花叶病毒-花生普通株系(Cucumber mosaic virus common strain,CMV-CA)和强毒力株系(CMV-CS)基因组全序列分析,并将PSV-Mi和CMV-CA复制酶基因片段和PStV外壳蛋白(cp)基因构建了病毒单抗和多抗植物表达载体,通过转化烟草,明确抗性效果,为以后转花生抗病毒育种提供理论依据。具体结果如下: PSV-Mi株系RNA1、2和3全长分别为3347个核苷酸(nt)、2966nt和2170nt,3个RNA组分大小和结构与已经报道的PSV株系一致。核酸序列同源性比较结果表明,PSV-Mi株系RNA1、2和3与国外报道的PSV-ER(亚组Ⅰ)和PSV-W(亚组Ⅱ)株系序列同源性都低于80%;与同属的CMV和番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)代表株系都低于70%。以上结果表明以PSV-Mi为代表的中国PSV株系独自构成一个PSV新亚组,即亚组Ⅲ。4个ORFs的系统进化树也表明,PSV-Mi、ER和W株系各自形成独立的进化分枝,进一步证实上述结论。 CMV-CA和CS株系RNA1和2长度相同,分别为3356nt和3045nt;RNA3长度相差7nt,分别为2217利2212nt。CMV-CA与CS的RNA1、2和3核苷酸序列同源性分别为:98%、99%和97%。两个株系3个RNA组分与CMV亚组Ⅰ核苷酸序列的同源性达90%左右,与CMV亚组Ⅱ株系低于80%,与PSV-ER低于70%。上述序列同源性比较结果表明:CMV-CA与CS株系亲缘关系最近;二者与CMV株系的亲缘关系较近,与同属PSV株系亲缘关系较远;CMV株系中,与亚组Ⅰ株系亲缘关系较近,与CMV亚组Ⅱ株系亲缘关系较远。5个ORF核苷酸序列及编码的蛋白质氨基酸序列同源性比较,得到相同的结论。 RNA3的5’端非编码区(NTR)核苷酸序列结构分析表明:CMV-CA利CS与CMV亚组IB株系结构特征相似,与CMV亚组IA和Ⅱ株系结构特征明显不同。5个ORFs核苷酸序列系统进化树分析表明,CMV-CA和CS亲缘关系最近,都分布于CMV-IB亚组。上述分析均证实我国花生CMV-CA和CS两个毒力不同的株系均属于CMV-IB亚组。尽管CMV和PSV在同一区域花生上发生,上述研究未发现二者之间RNA组分的重组合(reassortment),因此,CMV-CA和CS株系是我国特定的生态条件下,CMV发生遗传变异的结果。 针对PStV、PSV利CMV在同一区域花生上流行,应用3种病毒CP或复制酶基因片段构建病毒单抗和多抗植物表达载体,包含PStVcp基因的pKcp载体和3种病毒cp或复制酶基因150bp(或500bp大小片段)拼接片段的反向重复序列载体pK450和pK1500。借助于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101(pMP90)转化白氏烟(Nicotiana benthamiana),经过PCR检测,获得转基因植株。pKcp T0-T2代转基因烟草都获得对PStV不同程度的抗性。pK450和pK1500 T1代植株对PStV表现不同程度的抗性,对CMV均有一个系表现症状恢复抗性,对PSV全部感病。siRNA的Northern blot结果表明,所有转化的烟草植株都含有不同量的病毒siRNA。 3种载体都获得对PStV的抗性,说明PStVcp从150bp片段到完整cp基因都能有效诱导对PStV的抗性;pK450和pK1500载体都有一个系同时获得对PStV和CMV的抗性,表明应用RNA沉默策略可获得对这两种病毒的抗性。本项研究为针对3种花生病毒的单、多抗转基因花生的育种作了有益的尝试,目前正进一步构建新的载体,以增强对CMV和PSV抗性的表达。

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 文献综述

1 花生和花生病毒病

1.1 花生的经济重要性

1.2 花生病毒病

1.2.1 花生病毒病的概况

1.2.2 我国花生病毒病的特点

2 侵染花生的两种黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)病毒

2.1 黄瓜花叶病毒属

2.2 黄瓜花叶病毒

2.2.1 分类地位和亚组划分

2.2.2 基因组的组成与结构

2.2.3 蛋白质的功能

2.2.4 变异和进化

2.2.5 蚜传机制

2.3 花生矮化病毒

2.3.1 基因组的结构和功能

2.3.2 病毒株系和亚组

2.3.3 PSV的变异

3 植物转基因病毒抗性

3.1 RNA沉默的发现

3.2 RNA沉默的机制

3.3 RNA沉默的应用

4 本研究的目的和意义

第二章 花生矮化病毒基因组克隆和全序列分析

1 引言

2 实验材料

2.1 病毒

2.2 试剂

3 实验方法

3.1 病毒提纯

3.2 病毒RNA提取

3.3 病毒RNAs的RT-PCR扩增

3.3.1 病毒RNAs的5'终端片段扩增采用5'-Race方法

3.3.2 RT-PCR扩增病毒RNAs的cDNA

3.4 PCR产物回收

3.5 连接反应

3.6 大肠杆菌感受态的制备及转化

3.7 电击转化

3.8 质粒小量提取

3.9 酶切鉴定

3.10 cDNA的序列测定

3.11 cDNA序列的计算机分析

4 实验结果

4.1 5'Race的结果

4.2 PSV RNAs cDNA的克隆和鉴定

4.3 PSV全序列结果

4.3.1 病毒核酸大小和结构分析

4.3.2 PSV-Mi与其它PSV株系基因组结构的比较

4.4 PSV与相关病毒核苷酸和氨基酸序列同源性的比较

4.5 系统进化树绘制

5 讨论和分析

第三章 侵染花生的两个黄瓜花叶病毒株系基因组克隆和全序列分析

1 引言

2 实验材料

2.1 病毒材料

2.2 试剂

3 实验方法

3.1 植物总RNA的提取

3.2 引物设计

3.3 cDNA合成

3.4 cDNA克隆和鉴定参照上一章PSV-Mi的实验方法

3.5 序列测定、序列同源性比较和系统进化树的绘制

4 结果与分析

4.1 CMV-CA和CS基因组的RT-PCR扩增及克隆

4.2 CMV-CA和CS基因组的核苷酸序列及蛋白翻译

4.3 核苷酸、氨基酸序列同源性比较

4.4 CA和CS与CMV不同亚组株系RNA3的5'NTRs结构比较

4.5 基因组编码的5个ORFs核苷酸序列的系统进化树分析

5 讨论

第四章 单价和多价反向重复序列载体的构建和转基因抗性研究

1 引言

2 实验材料

2.1 质粒和菌株

2.2 试剂

2.3 植物材料

2.4 毒源

2.5 抗体

2.6 引物

3 实验方法

3.1 拼接PCR

3.2 拼接片段或PCR产物克隆至pGEM-Teasy载体

3.3 BP重组反应

3.4 LR重组反应

3.5 农杆菌感受态细胞制备及电击转化

3.6 烟草的转化

3.7 基因组DNA的小量提取

3.8 基因组DNA的PCR扩增

3.9 转基因植株的抗病性检测

3.10 转基因植株的siRNA的提取

3.11 siRNA的Northern-blot

3.11.1 siRNA电泳

3.11.2 siRNA转膜

3.11.3 探针制备

3.11.4 siRNA杂交

4 实验结果

4.1 拼接PCR

4.1.1 将3种病毒150bp片段拼接为450bp片段。

4.1.2 将3种病毒500bp片段拼接为1500bp片段。

4.2 拼接片段或者PStV cp基因克隆至pGEM-Teasy载体

4.2.1 450bp拼接片段克隆至pGEM-Teasy载体并鉴定

4.2.2 PStV cp克隆至pGEM-Teasy载体并鉴定

4.2.3 1500bp拼接片段克隆至pGEM-Teasy载体并鉴定

4.3 BP重组

4.3.1 pDONR450的鉴定

4.3.2 pDONRcp的鉴定

4.3.3 pDONP1500的鉴定

4.4 LR重组

4.4.1 pK450的鉴定

4.4.2 pKcp的鉴定

4.4.3 pK1500的鉴定

4.5 转基因烟草PCR检测

4.6 转基因烟草对病毒的抗性检测

4.6.1 转基因烟草T0代的抗性检测

4.6.2 转基因烟草T1代的抗性检测

4.6.3 转基因烟草T2代的抗性检测

4.7 转基因烟草的siRNA检测

5 讨论

结论

参考文献

缩略词(Abbreviation)

致谢

作者简介

发布时间: 2006-08-26

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