黄瓜叶片衰老过程中内肽酶变化及其生化特性的研究

论文摘要

叶片衰老是叶片生长发育过程中一个重要阶段，该期间蛋白质的降解是叶片衰老过程中一个极其重要的事件，蛋白质降解后的营养物质会运送到生长旺盛的组织或贮藏器官被再利用对后者的生长具有重要意义；另一方面叶片蛋白质，尤其Rubisco的降解影响光合作用的进行，对生物产量的形成和提高造成不良影响。因此研究和弄清叶片蛋白质降解机制具有重要的意义。许多研究认为内肽酶在叶片蛋白质降解中起主要作用，但不同植物中内肽酶种类、特性等存在差异，因此深入研究不同植物中内肽酶变化规律及其功能对揭示蛋白质降解机制有重要作用。黄瓜是我国栽培面积较大的蔬菜作物，由于黄瓜为无限生长植物，在生产中叶片早衰是影响黄瓜产量的重要因素，因此，延缓黄瓜叶片衰老无疑将显著增加其产量。但国内对黄瓜叶片衰老的研究主要集中在光合特性变化和栽培措施等方面，对其衰老机制尤其是叶片蛋白质降解与内肽酶的关系研究则几乎未见报道。本文研究了黄瓜叶片衰老过程中的主要生理生化特性变化，并重点对叶片蛋白质降解及其内肽酶同工酶变化及其生化特性等进行了研究，结果表明：黄瓜叶片衰老过程中，叶片的叶绿素含量、净光合速率、蛋白质含量和SOD活性降低，但MDA含量和POD活性增加；叶绿体结构发生明显变化，外形由长椭圆形逐渐趋于圆形；叶绿体内淀粉粒由多而大逐渐变少而小，油脂则由小而少变大而多；基粒片层由细长沿叶绿体长轴方向排列，逐渐变粗短，排列杂乱至模糊不清，内含物向细胞中扩散而最终导致叶绿体解体。因此叶片蛋白质的降解可能与叶绿体结构的变化和叶片内的氧化胁迫增加有关。为研究黄瓜叶片衰老过程中内肽酶变化对可溶性蛋白质降解的影响，采用以明胶为底物的梯度凝胶电泳活性染色方法，首次对自然衰老过程中黄瓜叶片内肽酶同工酶的变化进行了研究。结果表明，黄瓜叶片自然衰老过程中蛋白质含量在叶片伸出后15天左右最高，随后开始降低；内肽酶活性在叶片伸出35d后显著升高，此时叶片中蛋白质明显发生降解。黄瓜叶片内肽酶的最适pH为7.0，最适温度为40℃，内肽酶活性可被Ca2+、半胱氨酸等激活，内肽酶抑制剂分析显示丝氨酸类型的内肽酶活性占总活性的57％左右。梯度凝胶电泳活性染色方法检测到至少4种黄瓜叶片内肽酶同工酶，各同工酶活性变化和出现时期在自然衰老过程中不同；丝氨酸内肽酶同工酶2，3随叶片衰老活性增强，为黄瓜叶片中主要的内肽酶同工酶。为进一步了解黄瓜叶片衰老期间的各种内肽酶同工酶变化及其生化特性，采用离体叶片暗诱导处理进行试验，结果表明，暗诱导使叶片衰老加速，叶绿素含量快速下降，叶片蛋白质降解与内肽酶活力升高呈负相关。应用活性电泳方法检测到了黄瓜叶片暗诱导衰老过程中有9种内肽酶同工酶（CEP1-9），其中6种（CEP1，5，6，7，8，9）与衰老进程相关。而且，黄瓜叶片在自然衰老中出现的同工酶，在暗诱导衰老中也出现。对内肽酶同工酶生化特性研究表明，各种同工酶在40℃时活性最高，适宜的pH为6.0-8.0；其中CEP3热稳定性最高。所检测到的内肽酶同工酶中，CEP2，3，4，9内肽酶活性较强，为黄瓜叶片衰老中主要的内肽酶，它们在pH5.0-9.0的范围内均有活性，最适pH为7.0；温度低于25℃或高于60℃各内肽酶均没有活性。蛋白酶抑制剂试验分析表明，CEP2，3，4，9属于丝氨酸型内肽酶，CEP6为半胱氨酸型内肽酶，因此认为丝氨酸型内肽酶在黄瓜叶片衰老中具有重要作用。为深入了解黄瓜衰老叶片中活性最强的丝氨酸内肽酶的生理作用，采用丝氨酸内肽酶抑制剂AEBSF、ABA和GA处理的方法，研究了其对黄瓜叶片衰老的影响，结果表明，50μM 6-BA与丝氨酸内肽酶抑制剂AEBSF处理不仅能抑制叶片内肽酶活性的升高、延缓叶片蛋白质降解，而且能提高SOD活性，降低POD活性；而50μM ABA则促进了内肽酶活性的升高；但50μMABA+10mmol／L AEBSF处理后叶片内肽酶活性低于单独ABA处理。活性电泳显示，黄瓜叶片中检测到6条内肽酶同工酶，其中4条（CEP2，3，4，6）为丝氨酸型内肽酶，内肽酶抑制剂AEBSF抑制了叶片中丝氨酸内肽酶同工酶的活性，而ABA使丝氨酸内肽酶CEP2，3，4的活性显著增强，再次暗示了丝氨酸型内肽酶在黄瓜叶片衰老以及叶片Rubisco降解中具有重要作用，而且除了丝氨酸内肽酶外，可能还有其它因素参与了衰老的调控。还应用外源氮肥处理，研究了其对黄瓜叶片中蛋白质降解与内肽酶活性及同工酶变化的影响，以期了解N素对植物内肽酶表达和活性表现的影响。结果表明，随着叶面施氮浓度的提高，叶片蛋白质含量增加、而内肽酶活性减弱，在一定N浓度范围内，叶片生长正常，叶片没有衰老症状。高氮处理间内肽酶同工酶组成上变化不明显，但在低氮处理中，内肽酶同工酶活性增强、同工酶种类增加，可溶性糖含量增加，Rubsico出现降解现象，外源氮肥处理后14天后，各处理与缺氮培养叶片内肽酶变化相似并有新的内肽酶同工酶出现。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语词汇表
• 引言
• 文献综述
• 1.植物及叶片衰老的类型
• 2.叶片衰老机制的部分学说
• 3.叶片衰老期间生理生化的变化
• 4.叶片衰老过程中基因的差异表达
• 5.叶片衰老的调控
• 第一章 黄瓜叶片自然衰老期间部分生理生化指标及叶绿体超微形态变化
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 2.1 黄瓜叶片衰老期间叶绿素含量及净光合速率变化
• 2.2 黄瓜叶片衰老期间叶绿体超微结构的变化
• 2.3 黄瓜叶片衰老期间的叶片氧化伤害变化
• 2.4 黄瓜叶片衰老期间可溶性蛋白质含量变化
• 3 讨论
• 第二章 黄瓜叶片自然衰老期间蛋白质降解与其内肽酶同工酶变化及生化特性
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 黄瓜叶片自然衰老期间蛋白质变化
• 2.2 黄瓜叶片衰老期间叶片内肽酶活力的变化
• 2.3 黄瓜叶片衰老期间叶片内肽酶的生化特性
• 3 讨论
• 第三章 黄瓜叶片暗诱导衰老期间内肽酶同工酶变化及其生化特性
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 黄瓜叶片暗诱导衰老中叶绿素、蛋白质含量及内肽酶活性变化
• 2.2 黄瓜叶片暗诱导衰老期间内肽酶同工酶变化
• 2.3 pH值对黄瓜内肽酶同工酶的影响
• 2.4 温度对黄瓜内肽酶同工酶活性的影响
• 2.5 黄瓜暗诱导叶片内肽酶的热稳定性
• 2.6 不同蛋白酶抑制剂对黄瓜内肽酶同工酶的影响
• 3 讨论
• 第四章 丝氨酸类内肽酶抑制剂AEBSF延缓黄瓜叶片衰老的研究
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 2.1 AEBSF与激素对黄瓜叶片叶绿素含量、蛋白质变化的影响
• 2.2 AEBSF与激素对暗诱导黄瓜叶片中丙二醛含量变化的影响
• 2.3 AEBSF对暗诱导黄瓜叶片中SOD、POD活力变化
• 2.4 AEBSF与激素对黄瓜叶片内肽酶活性及同工酶的影响
• 3 讨论
• 第五章 氮肥对黄瓜叶片丝氨酸内肽酶同工酶活性及其组成的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 外源氮肥对黄瓜叶片叶绿素、蛋白质含量的影响
• 2.2 外源氮肥对黄瓜叶片可溶性糖影响
• 2.3 外源氮肥对黄瓜叶片N及蛋白质降解的影响
• 2.4 外源氮肥对黄瓜叶片内肽酶活性及同工酶变化的影响
• 2.5 不同N/C对黄瓜叶片Rubisco降解及20S蛋白酶体的影响
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 创新之处
• 存在的问题与展望
• 攻读学位期间发表的论文
• 致谢