真菌来源的抗凝活性蛋白TAP的研究

论文摘要

目前因心、脑血管血栓形成所致缺血性事件已成为威胁人类生命的最主要的一类疾病,研发新的抗栓药物具有巨大的潜在价值。抗栓药物分抗凝药、抗血小板药及直接溶解血凝快的溶血栓药三类。微生物具有种类多、代谢产物多样化的特点,为进行抗凝活性物质的筛选提供了丰富资源。本研以凝血酶能催化纤维蛋白原形成纤维蛋白,进而形成血栓的反应为基础,筛选药用真菌和放线菌的代谢产物的体外抗凝活性,筛选得到了较高抗凝活性的菌株CA03-1。进一步分别从热稳定性、酸碱稳定性、分子量大小、离子交换特性等方面对活性物质的分离纯化条件进行了研究,通过膜过滤、HZ-816 脱色、硫酸铵沉淀、透析去盐、DEAE-Sephacel 离子交换、Sephadex G-100 分子筛层析、冷冻干燥的步骤,得到了高度纯化的抗凝活性蛋白样品TPA。活性回收率为10.3%,比活力高到1.82×104IU/mg。样品TAP 经PAGE 凝胶电泳,银染显色结果为单一条带。反相HPLC 法测定表明样品TAP 纯度大于95%。SDS-PAGE 电泳结果表明TPA 由两种不同亚基组成,其分子量分别为29.2kD 和21.9kD。等电点测定表明pI 约为4.45 左右。抗凝活性蛋白为丝氨酸蛋白酶,对热敏感。在一定浓度范围内,MgSO4、CaCl2、MnCl2、KCl 对TAP 的抗凝活性起促进作用。胃蛋白酶和胰蛋白酶都不能降解TPA 的抗凝活性。

论文目录

• 摘要
• Abastract
• 文献综述
• 1 血栓形成的机理
• 1.1 血栓的类型和特点
• 1.2 血栓形成的机理
• 2 抗血栓活性物质的现状与研究进展
• 2.1 动物来源的抗血栓活性物质
• 2.2 植物来源的抗血栓活性物质
• 2.3 微生物来源的抗血栓活性物质
• 2.4 化学合成类抗血栓活性物质
• 2.5 基因重组技术来源的抗血栓活性物质
• 3 立题依据和意义
• 参考文献
• 第一章 抗凝活性菌株的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 主要培养基
• 1.3 样品及主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 方法
• 2 结果
• 2.1 放线菌的抗凝活性检测
• 2.2 药用真菌的抗凝活性检测
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二章 CA03-1 菌株抗凝活性蛋白的分离与纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 CA03-1 胞内外的抗凝活性
• 2.2 温度对凝活性蛋白抗凝活性的影响
• 2.3 不同分子量范围截流对活性蛋白抗凝活性的影响
• 2.4 不同pH 对CA 03-1 蛋白抗凝活性的影响
• 2.5 不同饱和度硫酸铵沉淀物的抗凝活性
• 2.6 脱色
• 2.7 离子交换分离
• 2.8 凝胶层析分离
• 2.9 抗凝物质的分离纯化过程
• 3 小结
• 参考文献
• 第三章 TAP 蛋白性质的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 温度对 TAP 抗凝活性的影响
• 2.2 TAP 的稳定性
• 2.3 不同金属盐类对 TAP 抗凝活性的影响
• 2.4 不同蛋白酶对 TAP 抗凝活性的影响
• 2.5 蛋白酶抑制剂对 TAP 抗凝活性的影响
• 2.6 TAP 的纯度
• 2.7 TAP 的等电点
• 2.8 TAP 的分子量
• 3 小结
• 参考文献
• 致谢